[发明专利]一种细菌鞭毛镀银法染色试剂及其染色方法

说明书

本发明属于一种细菌染色用试剂，以及使用该试剂染色的方法。

细菌鞭毛极为纤细，因此在普通光学显微镜中不能看到，通常采用一些特殊的染色方法将鞭毛显示出来。鞭毛染色的主要原理都是采用不稳定的胶体溶液作媒染剂，在鞭毛上生成沉淀，然后再进行染色。镀银染色法是一种常用的方法。原有的镀银染色法所使用的试剂包括甲液和乙液。甲液由丹宁酸、三氯化铁，福尔马林、氢氧化钠和蒸馏水配制而成，乙液为硝酸银溶液。上述试剂配备好后应在当日内使用，次日效果就较差，第三日该试剂就不能使用了。由于这种试剂不能长期贮存因此为实际工作造成很多麻烦。原有镀银染色法对菌种要求高，一般应接种后培养16-24小时后使用，如长期未移种，最好连续移种2-3次后再使用。另外染色过程中涂片是在室温下干燥，染色时间需三到五分钟。因此染色的整个操作时间较长。另外此法染色后鞭毛仍很纤细有清晰，效果不稳定，成功率低。

本发明目的是为镀银法细菌鞭毛染色提供一种新的试剂及其染色方法。该试剂可长期贮存不失效，染色操作简便、速度快，并且染色效果好。

本发明目的是通过如下方案实现的：本发明染色试剂包括有A液、B液、C液、A、B、C三种溶液配为：

A液：1.5-2.5％FeCL₃水溶液   50ml

     36％甲醛                0.3-0.5ml

B液：20％单宁酸              10-25ml

     1.0mol/l NaOH水溶液     0.1-0.4ml

     蒸馏水                  24.6-39.9ml

C液：2％AgNO₃水溶液         50ml

     浓氨水                  0.90-0.93ml

本发明试剂的染色方法如下：在清洁的载玻片上滴加少许蒸馏水，用灭菌接种针在经5-8小时培养的新鲜单个菌落上挑取少量菌苔点滴在载玻片上，玻片倾斜使菌液涂在玻片上，干燥后备用。取洁净试管滴加等量的A液与B液充分混匀，加热到出现蒸气颜色由黑兰变为透明棕色为止。稍冷却后滴在载玻片上染片40-90秒用流水洗尽。滴加C液后将玻片置于酒精灯上稍加热至产生微量蒸气而不干，染色30-60秒后流水洗去染液。

下面详细叙述本发明技术内容。

一、染色试剂的制备：

A液：1.5-2.5％FeCL₃水溶液50ml加入36％甲醛0.3-0.5ml混匀。

B液：20％单宁酸10-25ml加1.0mol/L NaOH水溶液

0.1-0.4ml混匀后加水补充至50ml。

C液：2％AgNO₃水溶液50ml缓慢加入浓氨水至出现很浓的沉淀，边摇动边继续滴入浓氨水到恰好沉淀消失成澄清液为止。

二、染色方法：

1、玻片的清洗：同常规方法

2、制片：在清洁的载玻片一端滴少许蒸镏水，用灭菌接种针沾少量蒸镏水在培养5-8小时的新鲜单个菌落上挑取少量菌苔轻轻点滴在载玻片上。将载玻片缓缓倾斜菌液涂布在玻片上，可在室温下自然干燥，也可放入37℃恒温箱中干燥。

3、染色：取一洁净试管滴加等量A液与B液充分混匀，加热到出现蒸气颜色由黑兰变为透明棕色止。稍冷后(不烫手)在玻片上滴加少许上述混合液染片40-90秒，然后用流水缓缓洗尽。再滴加少许C液，将玻片置于酒精灯上稍加热至微量冒蒸气而不干，染色30-60秒用流水冲去染液即可。

本发明试剂由于采用了分别配制的A、B、C三种溶液，因而可以长期贮存而不失效，使用时将A液与B液混合加热染片，再加C液染色。使用本发明试剂染色细菌只需培养5-8小时即可染色，同时染色的时间从3-5分钟缩短40至90秒。载玻片制作过程中不仅可在室温中干燥又可放入37℃恒温箱中干燥，这样加快了干燥的速度。因此本发明的染色方法操作简便工作时间短。另外本发明染色过程中由于采用了A、B液混匀加热染片后，滴加C液加热染色的方法使得胶体溶液的沉淀量增多，并且易沉淀在鞭毛上，因而染色后鞭毛粗大、清晰，立体感强，易于辨认。经分光光度仪扫描可以看出生成胶体化合物的量增多，因而染色效果明显优于原有镀银染色法。

实施例：

一、试剂的制备

A液：2％FeCL₃水溶液50ml加入36％甲醛0.4ml混匀。

B液：20％单宁酸水溶液20ml加入1.0mol/L NaOH水溶液0.3ml混匀，加入20.7ml蒸镏水混匀。