[发明专利]胞内分枝杆菌变态反应原提取方法

说明书

本发明涉及用于检测胞内分枝杆菌感染的变态反应原的制备方法，具体地讲，涉及以胞内分枝杆菌为原料，在一定条件下将胞内分枝杆菌培养后，处理菌体，提取制造胞内分枝杆菌变态反应原。其国际专利分类号C12N1/20。

胞内分枝杆菌变态反应原是检查非典型分枝杆菌感染的皮肤变态反应试剂，原提取工艺是将菌体经10磅20分钟高压处理后，从上清液中提取，该工艺产率低而且一些不耐热蛋白活性被破坏。

本发明的工艺过程中，将胞内分枝杆菌菌体，经80-82℃水浴处理，然后将菌体以超声破碎，从除去残留菌体后得到的上清液中，以盐析及酸沉淀法提取变态反应原，提取液经膜洗涤除去残留酸、盐、无机试剂，得到纯化变态反应原。本发明工艺简单、变态反应原提取率高，活性高于原提取方法2-3倍。成品可用于人体非典型胞内分枝杆菌感染诊断用。该提取方法适用于胞内分枝杆菌变态反应原或其它用于迟发型皮肤变态反应制剂的制备。

下面是本发明的技术方案：

1、菌液制备：

将对数生长期的胞内分枝杆菌菌体，转接于固体或液体普通培养基，37℃培养2-4周，收集菌体于生理盐水中。

2、菌体处理：

菌体置于80℃水浴1小时，离心收集上清液，菌体用生理盐水稀释后，以190W超声破碎，离心收集上清液，将两次收集上清液合并。

3、上清液中加入硫酸铵，4℃放置12小时，收集沉淀以生理盐水溶解，后加入三氯醋酸，收集沉淀，以无菌滤膜收集蛋白，以10％Nacl洗涤至无SO₄^2-，加入生理盐水除菌过滤后即成浓缩制品。

以下是本发明的实施例：

1、菌液制备：

将对数生长期的胞内分枝杆菌菌体，转接于固体或液体普通培养基，37℃培养2-4周，收集菌体于生理盐水中。

2、菌体处理：

菌体置于80℃水浴1小时，以6000转/分离心30分钟收集上清液。菌体用生理盐水稀释，以190W超声破碎(时间为30分钟共2次)，以6000转/分离心120分钟收集上清液，将两次收集上清液合并。

3、向上清液中加入饱和度为70-80％的硫酸铵，4℃放置12小时，过滤收集沉淀，用生理盐水溶解，然后加入饱和度为3-4％三氯醋酸，收集沉淀，用0.45μ孔径的硝酸纤维无菌滤膜过滤收集蛋白，以10％Nacl洗涤至无SO₄^2-，加入生理盐水溶解，除菌过滤后即成浓缩制品。

4、胞内分枝杆菌变态反应原的提取率与活性比较

(1)、提取率：用我们的工艺提取的PPD-B较国际通用的PPD-Rt23比较，高出2.147倍。

提取率：

(A)PPD-Rt23            1.740mg   PPD/g       菌体

(B)PPD-B               3.736mg   PPD/g       菌体

                                   B/A＝2.147

(2)活性比较：

          剂量          变态反应原均径(mm)动物标化：0.5μg/PPD-B            14.38

      1.0μg/DM-PPD           11.19人体标化：                                1μg/标准PPD-B  比值

                                            (mm)

      1μg/PPD-B              13.91         10.31    1∶2.35

      0.5μg/PPD-B            15.47         11.18    1∶2.38

      0.125μg/PPD-B          14.63          7.69    1∶2.09