[发明专利]利用毒力虫霉生产杀蚜虫生物制剂的方法

说明书

本发明涉及微生物领域，更具体地说，涉及利用毒力虫霉生产杀蚜虫生物制剂的方法。

蚜虫是一群种类多、繁殖快、分布广和危害大的农作物害虫，除自身危害作物外，还是植物多种病毒病的传播媒介。据有关部门统计，我国有数10种蚜虫已成为每年重点防治对象，如小麦抽穗灌浆期受麦长管蚜危害后，小麦千粒重明显下降，可导致减产30-40％；棉花苗期受棉蚜危害后，不仅推迟现蕾，而且单株产量减少30％以上；蔬菜瓜果等作物受害也甚严重。在这些作物上，每年用于防治蚜虫的农药占用药总量的30-40％，由于农药用量加大，不仅严重污染环境和农产品，而且大量杀伤害虫的天敌，引起农田生态平衡的恶性循环。另一方面，随着化学农药使用量的增加，蚜虫的抗药性也不断增长，例如，从50年代至今，棉蚜的抗药性已上升了13D-150倍。因此，人们非常希望能够研究出一种不会象化学农药那样导致生态平衡破坏的用于杀灭蚜虫的生物制剂。

本发明人在1982年从危害萝卜的菜缢管蚜罹病虫体中分离出一种使蚜虫致病的真菌-毒力虫霉菌株(程素琴，对菜缢管蚜虫的虫霉研究初报，《微生物学通报》11(1)：P1-2，1984)，后来已将此菌株保藏于中国微生物功菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为1995年6月2日，保藏号为CGMCC-0226，菌株命名为Entomophthoravirulenta(下称毒力虫霉CGMCC-0226)。本发明人对毒力虫霉CGMCC-0226进行了杀灭蚜虫的各种研究，结果发现，毒力虫霉CGMCC-0226本身虽然可使蚜虫致病，然而只有在90％以上的湿度下才能使蚜虫致病死亡。再经过深入的研究后发现，在毒力虫霉CGMCC-0226体内含有一种代谢产物，这种代谢产物对蚜虫具有很强的杀伤力而对其他动物的毒性很低，而且也不会伤害蚜虫的天敌如草蛉、蚜虫蜂等。本发明人采用石油醚从毒力虫霉CGMCC-0226的菌丝体中提出可溶物，过滤后经过浓缩，再往石油醚中加入无水乙醇，获得一种白色片状结晶。将此白色结晶溶于石油醚或丙酮中，以1mg/1ml的浓度对蚜虫和红蜘蛛(即叶螨)进行触杀试验，证明此提取物对蚜虫和红蜘蛛具有极大的伤杀力。本发明人将此提取物称为灭蚜菌素A，经过红外和质谱分析鉴定，证明此杀蚜菌素A是一种已知化合物Ergost-5-en-3-01。根据这些实验结果，本发明人推断，罹病蚜虫体内的毒力虫霉素CGMCC-0226在湿度低的气候条件下菌体繁殖受到抑制，并且不能大量地向体外分泌其代谢产物—灭蚜菌素A，故难以将蚜虫杀死。因此，如果能利用毒力虫霉CGMCC-0226来大量地生产出含灭蚜菌素A的物质，即可获得一种不会导致生态平衡破坏的杀灭蚜虫的生物制剂。

从而，本发明目的是提供一种利用毒力虫霉来生产蚜虫的生物制剂的方法。用这种方法制得的生物制剂，既能有效地杀灭蚜虫，又不会破坏自然生态平衡，而且对人和家畜家禽等动物的毒性很低。

本发明人经过较长时间的研究，筛选出最合理的发酵培养基和助剂配方，确定了最有利于毒力虫霉CGMCC-0226的菌体生长繁殖和灭蚜菌素A生成的工艺条件，按照这些条件来培养毒力虫霉CGMCC-0226菌体，既能使该菌体本身迅速繁殖，又能使菌体在发酵条件下通过一部分菌体的溶解作用而释放出大量的灭蚜菌素A，从而使所获的产品既具有毒力虫霉CGMCC-0226菌体孢子侵染蚜虫以使蚜虫致病而失去活力的作用，又具有灭蚜菌素A高效杀灭蚜虫的作用，灭蚜效果显著，而且生产工艺简单，成本低廉。由于这些实验结果，从而完成了本发明。

本发明提供了一种利用毒力虫霉生产杀蚜虫生物制剂的方法，包括摇瓶发酵一级种子培养、大规模发酵生产和后处理步骤，其特征在于，其具体步骤如下：

①、一级种子培养

将萨氏葡萄糖培养基(按重量计含葡萄糖2-6％、蛋白胨0.5-2％、酵母0.2-1％的水溶液)加入三角瓶或小型培养罐中，高温灭菌，待冷却后往其中接种毒力虫霉的斜面菌种，然后在25-32℃，优选27-30℃的温度条件下摇床培养30-50小时，获得的菌液备用；

②、大规模发酵生产

使用的培养基配方如下：

成分                                    重量％

花生饼粉                                0.5-2

黄豆饼粉                                0.5-2

玉米粉                                  1-3