[发明专利]高热稳定性β－半乳糖苷酶基因

说明书

本发明涉及一种耐SDS的高热稳定性β-半乳糖苷酶的编码基因，用此基因或其部分克隆半乳糖苷酶基因的方法，及生产用于例如食品工业和制糖业的这种酶的基因工程方法。

已在动物、植物和微生物中发现了β-半乳糖苷酶，它是一种能够分解β-半乳糖苷的酶。已知该酶特别存在于细菌如大肠杆菌、乳链球菌枯草杆菌、嗜热链球菌和Solfataricus硫化叶菌中。利用其水解乳糖成为半乳糖和葡萄糖的能力。这种β-半乳糖苷酶用于生产低乳糖奶。它还用于从在奶酪的生产工艺中形成的大量奶清中所含乳糖生产半乳糖或葡萄糖。

因此，为了将β-半乳糖苷酶应用于食品加工，要求开发一种能经受高温使用的酶，高温一方面是为了防止在加工过程的微生物污染，另一方面是为了提高作为底物的乳糖的溶解度。

另外，近年来利用β-半乳糖苷酶糖基转移反应进行各种糖化合物的生产(日本专利公开NO.25275/1994和14774/1994)。因此，需要开发高热稳定性的酶。

例如源自Sulfolobus Solfataricus的β-半乳糖苷酶[EuropeanJournal of Biochemistry，187，321-328(1990)]是一种耐热酶，其在90℃时有活性。但在85℃处理180分钟后，其活性减至约50％。

在例如European Journal of Biochemistry，213，305-312(1993)中描述了产自高嗜热细菌Pyrococcus furiosus的β-半乳糖苷酶在高温下有活性，从而保证了高热稳定性。本发明者发现了一种高热稳定性β-半乳糖苷酶，在90℃处理120分钟后，其残余活性比为约80％，并成功地分离了三类β-半乳糖苷酶(欧洲专利会开NO.0592158 A2)。

这三类β-半乳糖苷酶都是高热稳定性的，其中一类β-半乳糖苷酶极其稳定，甚至在1％十二烷基硫酸钠(SDS)存在下显示活性。

如上所述，在高温下进行的食品加工和糖化合物生产中要求耐热和热稳定性酶。另外，如果甚至在强表面活性剂SDS存在下酶具有活性，其应用范围就更广。

本发明的目的是分离具有改进的耐热性，良好的热稳定性和耐受表面活性剂的β-半乳糖苷酶的编码基因，及用上述基因生产高热稳定性β-半乳糖苷酶的工业方法。

概括起来讲，本发明的第一方面涉及源自Pyrococcus furiosus的分离的耐SDS高热稳定性β-半乳糖苷酶基因。本发明的第二方面涉及根据本发明第一方面的基因，它编码具有如SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或其部分并具有高热稳定性β-半乳糖苷酶活性的片段。本发明的第三方面涉及根据本发明第一方面的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示。本发明的第四方面涉及一种耐SDS的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因，它能与根据本发明第二方面的基因杂交。本发明的第五方面涉及一种克隆高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的方法，它包括根据本发明第1-4方面之一的基因或其部分用作探针或引物。本发明的第六方面涉及高热稳定性β-半乳糖苷酶的生产方法，它包括培养转化子，该转化子中已导入了含有根据本发明第一方面的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因的重组质粒，然后从培养物中收获高热稳定性β-半乳糖苷酶。

含本发明中的编码高耐热β-半乳糖苷酶的分离DNA的高热稳定性β-半乳糖苷酶基因，可通过使用粘性质粒载体的表达克隆方法筛选得到。表达克隆是一种可被用于在无靶酶一级结构的任何信息的情况下克隆某些酶的编码基因的方法。例如，用表达克隆方法克隆了Pyrococcus Woesei的支链淀粉酶基因(WO 92/02614)。但该方法不能应用于所有类型的酶，因为在质粒载体用于该方法时，需要非常适当的限制酶；它必须将靶基因切得足够小以插入质粒载体中，而又不在靶基因的内部切割。另外，因为需要几次克隆，这种方法很复杂。

因此，本发明者试图通过用Pyrococcus furiosus基因组DNA构建的粘性质粒文库中筛选β-半乳糖苷酶活性，来分离β-半乳糖苷酶基因，该粘性质粒载体中插入的DNA片断(35-50kbp)要比质粒载体中的大。通过使用粘性质粒载体，用限制酶切在编码酶的靶基因内部的危险性降低，并且需测试的克隆数减少。相反，产生了检测不到酶活性的危险，这是因为粘性质粒载体在宿主生物中的考贝数比质粒载体的少，因而酶的表达水平低。