[发明专利]重组的感染性不分节段的负链RNA病毒

说明书

本发明涉及一种遗传工程得到的感染性复制性不分节段的负链RNA病毒突变体，和这种突变体的制备方法。

狂犬病病毒(RV)是棒状病毒科的不分节段的负链RNA病毒的一个实例。属于此科的其它病毒种为水泡性口炎病毒(VSV)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)，病毒性出血性败血病病毒(VHS，Egtved病毒)，牛暂时性发热病毒(BEFV)，和苦苣菜黄网病毒(SYNV)。

除棒状病毒科以外，属于副粘病毒(如sendai病毒(SV)，2型和3型副流感病毒(PIV)、新城疫病毒(NDV)、流行性腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MEV)和犬热瘟病毒(CDV)和丝状病毒科的病毒，以及几种未归于某科的病毒(如Borna病病毒；BDV)均具有不分节段的负链RNA基因组。

各类的不分节段的负链RNA病毒中全基团结构是有可比的。特别是在副粘病毒和棒状病毒之间，在全基因结构上仅有很小的区别(Tordo等，Seminars in Virology 3：341－357，1992)。

RV可感染所有温血动物，在出现症状后这种感染最后几乎都导致死亡。犬狂犬病在世界上许多地方仍很重要：全世界每年发生的约75,000例人狂犬病例的大部分是由感染的狗引起的。在欧洲许多国家、和在美国加拿大，野生动物狂犬病的重要性日益增加。

在大部分物种中，狂犬病的临床特征相似，但在个体间存在很大的差异。在被狂犬病动物咬伤后，潜伏期一般为14-90天，但也可以相当长，有潜伏期超过一年的记录。该疾病的两个临床形式为狂暴性和早瘫性或麻痹性。在狂暴性形式中，动物变得不安、烦燥、富攻击性，并且通常是危险的，因为它失去了对人的一切恐惧，会咬任何引起其注意的东西。该动物经常不能吞咽，引起该病的症状“恐水症”。经常有过量的唾液、对光和声反应过度、及感觉过敏。随着脑炎的发展，瘫痪取代了狂暴，如从该病的早瘫性形式的全过程中所见，动物显示相同的临床特征。最后，常有抽搐发作、昏迷、和呼吸停止，临床症状开始后2-7天发生死亡。

当被狂犬病动物咬伤或偶发的抓伤，或当狂犬动物的带病毒唾液进入伤口时，狂犬病毒进入体内。在咬伤部位(肌肉)中病毒复制后，开始侵入外周神经末稍，及病毒基因组在轴突胞浆中向中枢神经系统运动。病毒进入脊髓再进入脑(特别是缘系统)与神经障碍的临床症状有关。一般，大约在中枢神经系统感染引起狂暴的同时，病毒颗粒从唾液腺中的粘液分泌细胞的顶端散发出来，以高浓度运送至唾液中。

在狂犬病的整个过程中，仅轻微地激起宿主炎症和特异的免疫应答；对此最合理的解释是因为此感染在肌肉中和在神经细中是非致细胞病变的，而且因为此感染大量集中在神经系统的免疫隐蔽区中。

像所有的棒状病毒那样，RV病毒由两个主要结构成分组成：核衣壳或核蛋白(RNP)核心和围绕RNP核心的双层膜形式的包膜。所有棒状病毒的感染性成分为RNP核心。此基因组RNA是反义的，因此不能作为信使，但要求其自身内源性RNA聚合酶转录mRNA。核衣壳(N)蛋白结合两种小蛋白(即RNA依赖性RNA聚合聚(L)和磷蛋白(P))包装此RNA基因组，形成RNP核心。膜部分含两种蛋白质：跨膜糖蛋白(G)和位于膜内侧的基质(M)蛋白。G蛋白在RV中负责细胞附着和膜融合，另外还是宿主免疫系统的主要靶点。

在转录过程中，此基因组指导一短的先导RNA和含5个单顺反子的、加帽的多聚腺苷化的mRNA的序列合成。在复制过程中，顺反子间的条件性转录终止和启动信号不被病毒聚合酶所识别。对于转录酶反应和复制酶反应，都要求与RNA基因组复合的N-蛋白以及L-蛋白和P-蛋白的存在。已测定了RV基因组上的基因顺序，其为如图1所示的3’-先导序列-N-P-M-G-L-5’。转录后，RV的每个mRNA立即被翻译。与复制过程中相继发生两个过程：先产生与基因组互补的衣壳化的完整的正链RNA，然后产生同样由N、L和P蛋白衣壳化的完整的负链RNA。最后，新组成的RNP核心在组装和芽殖过程中与M-蛋白及G-蛋白结合，导致装配好的感染性RV病毒颗粒的释放。

11.9Kb的基因组RVRNA含有5个开放阅读框架(ORF)，编码N、P、M、G和L蛋白，另外在G和L基因之间存在假基因区(ψ)(图1)。