[发明专利]一种植物细胞抗衰老剂(PG)

说明书

本发明属于植物组织和细胞培养技术领域具体涉及植物细胞和组织培养用的培养基及DNA提取液的制备。其国际专利分类号为C12N5/00。

衰老(Senescence)是生物的一个自然过程，但有些情况下的衰老是由环境条件恶化而引起的，当环境得到改善时，衰老即可延缓。衰老的生理过程与体内的激素变化密切相关。其中最引人注目的是乙烯的变化。Yang等提出乙烯在植物体中的合成途径是蛋氨酸(Met)→S-腺苷蛋氨酸(SAM)→1-氨基环丙烷基羧酸(ACC)→乙烯^[14]。(见：Yang，S.F.1985，Hortsci.，14：59-60)，许多抗衰老剂和保鲜剂均依照Yang的理论在配方中加入乙烯拮抗剂和抑制剂。例如Ag(S₂O₃)₂，AVG(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸)、AOA(氨基氧乙酸)(Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soci.Hort.Sci.，10：517-520.)等。但AVG生产成本较高而不能用于商业，AOA也未能大量应用于实际中。Baker发现乙烯的合成和自由基的存在有关(见：Baker，J.E.et al.，1978，Plant Physicl.，61：886-888)，所以又有些研究者用一些自由基清除剂来抗衰老，如苯甲酸(见1978，Plant Physicl，61：886-888)和醅酸正丙酯(见：Wang，C.Y.et al.，1977，J.Am.Soei.Hort.Sci.，10：517-520)。悬浮培养的细胞的衰老-则是由于细胞间相互营养竞争引起，更重要的是细胞生长条件的恶化。如环境中由于代谢而产生的有害物质，特别是氧化物质，所以研究者常把抗氧化剂如抗坏血酸、硫代硫酸钠等添加到培养基中。硫代硫酸钠的抗氧化效果不好，抗坏血酸虽有较好的抗氧化效果，但其本身的化学性质极不稳定。通常人们认为悬浮系的褐化是有害物质累积的结果，故采用一些吸附物质，如活性炭，来改善细胞的褐化。但其易吸附培养基中的有效成份而改变培养基的性质。本发明者认为，pH值的变化会对细胞的生长产生广泛而深远的影响，优化培养液的pH值是抗衰老最有效而简便的途径。悬浮培养中，细胞选择性地吸收NH₄⁺、K⁺等阳离子，会使培养液酸化，蔗糖的分解也是一个因素，再加之细胞本身向外分泌一些酸性物质，从而加快了酸化速度。由于酸化可能影响到一些营养的吸收及体内的代谢活动，进而影响生长。当NO₃^-被吸收时，培养液的pH值会升高，当pH值升高到一定程度(＞6.2)时，会影响细胞对铁的吸收，由于缺铁，生长即告停止。生物体内的许多生化反应是要求在一定的pH值下进行的，所以pH值的变化会影响到代谢。在原生质体培养中Davey(1983)观察到pH值除了直接影响原生质体及再生细胞的生理活动外，还能影响外源激素对培养物的毒害性。pH值在5.6或6.0时，2，4-D浓度超过1mg/L时就能对低浓度培养物产生毒害。pH值的变化还可影响到氧化还原电位。(见In Protoplast 1983，LectureProceeding Birkhuser Venlage，Basel.pp.19-29)。植物本身对pH值的缓冲能力是非常有限的，所以人们为了稳定pH值，在培养液中添加Ca(H₂PO₄)₂、CaCO₃、MES等(见中科院上海植生所，1978，植物组织和细胞培养，上海科学技术出版社p195)。但钙盐稳定pH值的效果不是很好，MES虽有较好的pH值稳定效果，但其价格昂贵且依赖进口，大规模使用是不现实的，所以寻求较为理想的pH值缓冲物质是非常有意义的。d′Utra-Vaz(1992)在原生质体培养时对培养物加以无菌的分子氧流从而促进了原生质体的植板和克隆的形成，悬浮培养时，环境的供氧状态对细胞生长至关重要。(见：1992，Plant Cell Report，11(8)：416-418)。一般培养条件下的供氧是不足的。如果人为过于增加环境的氧分压并降低CO₂的浓度就可能剌激乙烯的产生，因为CO₂是乙烯的抑制物质。(见Uota，M.，1969，J.Amer.Soc.Hort.Sci.，94：598-601)。所以除氢保氧是良好的解决途径。棉花、花生等含酚类物质的作物依一般方法提取的DNA有发红现象，这影响到以后的酶切。Andrew曾用DIECA来解决这一问题(1993.PlantMdecular Bidogy Reporter，11(2)：122-127)。DIECA价格昂贵，国内应用依赖进口。