[发明专利]一种双功能层析材料及制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物化学领域。

亲和层析技术是一种根据生物分子的生物学特性和化学结构进行分离纯化的技术，即将一种与被分离物质具有特异性吸附的配基通过直接或间接的方法与载体结合制成亲和吸附剂，用于分离纯化某种酶或蛋白质。疏水层析技术是根据生物分子表面疏水性不同进行分离纯化的方法。

苯酚和环氧氯丙烷在特定条件下的反应产物与琼脂糖(如：Sepharose)交联，即可制得一种具有疏水作用的层析材料(如：Phenyl Sepharose，Pharmacia公司产品)。

苯扎嘧啶(Benzamidine)通过6-氨基正己酸与琼脂糖交联，即可制得一种亲和层析材料(如：Benzamidine SepharoseCL，Pharmacia公司产品)。

上述两种层析材料为现有产品，但分别作为一种层析材料在对多组份生物物质的分离纯化中其特异性和选择性均具有局限。

本发明的目的在于针对上述缺陷，提出一种双功能层析材料和制备方法，以及采用该层析材料去除尿胰蛋白酶抑制剂中人尿激肽释放酶和纯化激肽释放酶的方法。

本发明的双功能层析材料，满足下列结构要求：

这里X＝C₆H₅_

    Y＝_NHC₆H₅C(NH)NH₂

    R代表一种琼脂糖。

本发明的双功能层析材料的制备方法步骤如下：

1)环氧化合物的合成：

取苯酚和环氧氯丙烷在碱性条件下回流，使其充分反应，去除水层，减压蒸馏得到1，2-环氧-3-苯氧基丙烷；

2)苯基-载体交联复合物的制备：

任何不溶于水的琼脂糖作为载体材料，将载体与适量1，2-环氧-3-苯氧基丙烷在室温条件下直接交联制得苯基-载体复合物；

3)苯基-载体-苯扎嘧啶交联复合物的制备：

将苯基-载体复合物用溴化氰或其他激活剂活化，分别加入6-氨基正己酸和对氨基苯扎嘧啶盐酸盐，制得苯扎嘧啶双功能层析材料。

采用本发明双功能层析材料，根据在特定条件下对人尿激肽释放酶的吸附作用，可成功去除尿胰蛋白酶抑制剂中人尿激肽释放酶；并在一定的PH和离子强度条件下进行洗脱，纯化出人尿激肽释放酶。

实施实例I

1.环氧化合物的合成：

取376克苯酚和748克环氧氯丙烷，置2000ml装有回流冷凝管、滴液漏斗的三颈圆底烧瓶中，加热回流并滴加20％氢氧化钠溶液600克，回流2小时，放冷。倒入分液漏斗分去水层，有机层用200ml蒸馏水(加20％氢氧化钠溶液1.0ml)分三次洗涤，除去水层，再加50ml乙醚振摇加速分层。有机层再用100ml蒸馏水分二次洗涤，去除水层，有机层再加入150克无水硫酸钠吸收残余水份。将有机层倒入减压蒸馏装置中，在5mmHg条件下减压蒸馏收集沸点在110℃左右的馏分液。制得1，2-环氧-3苯氧基丙烷。

反应方程式：

2.苯基-载体交联复合物的制备：

取约3000ml沉淀体积的琼脂糖4B(Spharose 4B，Pharmacia公司产品)，用沙芯漏斗抽滤，用0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再用大量蒸馏水冲洗，除去其中的保护剂和防腐剂。加入2000ml的1mol/L的氢氧化钠、240ml的1，2-环氧-3-苯氧苯丙烷和3克四氢硼钠在室温(30℃)下搅拌至少12小时。再加热至50℃，加入3克的四氢硼钠搅拌5小时。反应完毕后抽滤，加蒸馏水洗涤。置95％乙醇中浸泡12小时，过滤，保存在95％乙醇中。制得苯基-琼脂糖4B复合物。

反应方程式：

其中：HO-R-OH代表载体琼脂糖4B

3.苯基-载体-苯扎嘧啶交联复合物的制备：

取1000ml沉淀体积的苯基-琼脂糖4B交联复合物。抽滤，用水洗涤三次，加600ml水和100克溴化氰置冰盐浴(-10℃)中滴加2mol/L氢氧化钠溶液，使pH值保持在11.0～11.5之间10分钟后移至室温旋转10分钟后倒入沙芯漏斗中，立即用冷0.1mol/L碳酸氢钠(pH9.5)缓冲溶液抽洗，在2～3分钟内洗下5000～6000ml体积的缓冲溶液，终止活化。