[发明专利]标记分析固相材料表面活化方法

说明书

本发明属于生物标样(血、尿及其他)标记分析材料的制备方法。固相法是当今标记分析的发展方向，标志着标记分析的水平。与液相法比，固相法特别是夹心固相法，更灵敏，更准确，操作更简单，更适合自动化。固相法的基础是固相表面的活化技术。人们创造了许多活化方法。其中JeanCause的方法，是近年被推祟的。它是利用苯乙烯-顺丁二酸酐共聚体包被塑料。具体方法是将顺丁烯二酸酐溶于苯乙烯中，加入过氧化苯甲酰作催化剂，在85℃水浴条件下聚合。马上放到冰水中冷却。多聚体溶解在丁酮中，用乙腈改变溶解性。每支聚苯乙烯管加1ml活化液，即刻吸出。管子经24小时自然干燥即为活化管。JeanCause采用二氧六环-乙酸处理管子随后加甲醇-乙酸酐，马上水洗达到活化管子的目的。Butter J.E.利用浓硝酸处理聚苯乙烯管变聚苯乙烯管表面为硝化聚苯乙烯，在强碱性条件下，用硫代硫酸钠还原成氨基聚苯乙烯。在酸性条件下，经亚硝酸进一步还原成偶氮聚苯乙烯，可以连结抗体。氨基聚苯乙烯与蛋白质结合的方法很多，可以首先与溴乙烯溴，二氟二硝基苯，碘化乙酰酐，氯化苯偏二酸酐、戊二醛、碳化二亚胺等结合，形成可以与蛋白的氨基相结合的集团。Parsons J Barrett、George等均提出了用戊二醛活化固相表面或聚合蛋白达到抗体蛋白结合到固相表面的目的。Bondet F在免疫学方法杂志上介绍了紫外光处理聚苯乙烯管，以企增加抗体的结合，用于酶联分析。综上所述，活化固相表面的方法很多但都离不开强酸、强碱、易燃、易爆、剧毒物质，生产工艺复杂，成本高，有废水、废物产生，而且结合容量小。

本发明的目的就是为克服上述现有技术的不足，发明一种不用强酸、强碱和易燃、易爆、剧毒物质，而且工艺简单，成本低廉，不产生废物，废水的标记分析固相材料活化法。

本发明是在大量试验的基础上，发现了在弱碱性条件下，用丙烯醛的饱和水溶液，可以在固相表面聚合形成一个带有活性醛基的包层。本发明就是在此发现的基础上提出了新的固相材料表面活化法，本发明的技术方案如下：

(1). 被活化表面的材质：本方法可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙等固相材料表面。其材质可以做成管、球、珠、柱、片状物体，其表面部可以用本发明活化

(2)活化试剂：①PH8.6的无氨离子及氨化合物的缓冲液；②丙烯醛；③活化液的配制：加0.5克丙烯酰胺到100ml PH8.6  0.04M巴比妥缓冲液中，再加0.5ml丙烯醛混合，出现凝聚可滤除。

(3)固相表面活化方法：可用自动或手工，加一毫升活化液到聚苯乙烯管内。不要触及管壁，不要倾斜，在室温下静置1-4小时，用泵吸去活化液，自然干燥，即为活化管。这种活化液可以活化聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙等多种材质，可以活化管、球、珠、环、片等形体表面。

(4).活化表面的用途：经表面活化的管子、球、珠、环、片、柱等固体表面，有一层能够结合抗原、抗体或其他含有氨基的物质。这种结合了抗原抗体的固相材料可用于放射性标记分析、酶标记分析、荧光标记分析、DNA分析测定。下面具体介绍本发明的操作条件：

一.活化条件的优选与确定：

1.丙烯醛浓度对活化效果的影响：以不同浓度的活化剂活化试管，以最适包被条件包被抗体，比较各种浓度的活化剂活化试管结合的放射性。

活化剂浓度(％) 0.1   0.25  0.5  1     2

结合放射性Kcpm 16   15.5  15.5 16.5  16.5上述结果说明，活化剂浓度相差20倍对活化效果无影响。

2.活化酸度对活化效果的影响：

活化酸度(PH)     6.4 7.4 8.6 9.2 9.8 10.3

结合放射性(Kcpm) 3.6 3.9 9.3 8.9 8.6  9.0

上述结果说明，最佳活化酸度为PH8.6

3.稳定剂0.5％丙烯酰胺对包被抗体稳定性的影响：加有稳定剂的活化管，在最适宜条件下包被并加表面处理，干燥后，开放常温保存一定时间，加相应标记抗原，过夜，弃液体，水洗后测放射性。

包被管存放时间(月)   0     1     2     3

加稳定剂  (Kcpm)    43.5  38.3  37    34.2

不加稳定剂(Kcpm)    43.5   3.1  1.0    -

从上表可以看出不加稳定剂保存一个月活性损失90％以上，加了稳定剂保存三个月活性无变化，若塑封低温避光保存，活性保存更好。