[发明专利]用亲合色谱法提纯水蛭素的方法

说明书

本发明涉及的是水蛭素的提纯方法，更具体地说涉及的是用亲合色谱法提纯水蛭素的方法。

由水蛭、医用水蛭中分离出的水蛭素是一种凝血酶抑制剂，它由65-66个氨基酸组成。已公知有约11种水蛭素变体，根据N-末端氨基酸序列将它们分成两组：N-末端氨基酸为Val-Val(Bagdy等，Meth.Enzymol.45,669(1976))的HV1和N-末端氨基酸为Ile-Thr(Walsmann & Markwardt,Thromb.Res.40,563(1985))的HV2。HV1和HV2两者都已用于治疗血栓形成。水蛭素表现的凝血酶抑制常数(Ki)为10-11M至10-14M，这表明水蛭素能以很低的浓度抑制血液凝结(Mao等，Anal.Biochem.161,514(1987))。特别是，临床试验证明水蛭素没有如过敏、免疫反应、循环机能变常的副作用(Markwardt等，Thromb.Haemostas,52,160(1984))。

由一个医用水蛭中可获得的水蛭素的量少至20μg(Markwardt,Meth.,Enzymol.,19,924,1970)。因而，已有许多偿试以通过培养遗传工程微生物来大量生产水蛭素(作为综述，可参见Fareed等，Blood coagulation and Fibrinolysis,2,135(1991))。

Riehl-Bellon等采用阴离子交换色谱法和反相HPLC来提纯通过基因克隆技术生产的水蛭素(Riehl-Bellon等，Biochem.,28,2941(1989))。Misawa等在DEAE-Cellulofine、Butyl-Toyopearl、Sephadex G-25和Q-Sepharose上依次进行柱色谱法来从重组体E.coli培养物中提纯HV2(Misawa等，Proceeding of ApBiochEC.P.62(1992))。

然而，开发出的这些方法仅用来检测宿主细胞中产生的水蛭素，不适合应用于水蛭素的定量提纯。

采用注射剂型的医用重组体蛋白质应是高度纯化的，从制品的安全性和经济方面来看提纯是很重要的。

为提纯医用蛋白质，使用抗原-抗体反应的免疫亲合色谱法已被采用。但免疫亲合色谱法具有一些缺点：它易于失活且昂贵。因而，它的应用局限于提纯方法的最终步骤。

在这些情况下，本发明人为提供更方便且更经济地提纯水蛭素的方法进行了广泛的研究，其结果发现，使用金属离子亲合色谱法，其中以铜离子(Cu++)用作亲合吸附剂(金属离子)并以磷酸盐缓冲剂用作洗脱液，可以实现所述的目的。

因而，本发明的目的之一是提供以低的费用提纯水蛭素的方法。

本发明的另一目的是提供应用金属离子亲合色谱法提纯水蛭素的方法，其中铜离子(Cu++)用作亲合吸附剂(金属离子)，磷酸盐缓冲剂用作洗脱液。

本发明的再一目的是提供从含有水蛭素和其它物质的溶液中提纯水蛭素的方法，该方法包括以下步骤：

使铜化合物溶液流经装有配位体的柱以使铜离子(Cu++)吸附于所述配位体上；

向所述的柱上装填含有水蛭素和其它物质的溶液以使水蛭素与铜离子结合；

从铜离子上除去水蛭素并使用磷酸盐缓冲剂作为洗脱液从柱中洗脱水蛭素。

从以下的说明中本领域的普通技术人员可以清楚看出本发明的其它目的、特点和用途。

1975年首次开发了其中以金属离子用作亲合吸附剂的金属离子亲合色谱法用来分离人血清蛋白(Porath等，Nature,258,598(1975))。Porath等人的方法是，依靠氨基酸与金属离子的亲合性，使一些具有咪唑结构的氨基酸结合于金属离子上，所述的金属离子吸附在装填于色谱柱内的配位体上，然后通过使用洗脱液降低所述氨基酸与金属离子间的亲合性从金属离子上脱除氨基酸。所述金属离子的实例可以是如Cu⁺⁺、Ni⁺⁺和Zn⁺⁺的二价金属离子。从工业的角度看金属离子色谱法具有的优点是，用来吸附金属离子的配位体易于制备且其稳定性极好，固定基质(或载体)可以循环。

目前还没有人偿试过应用金属离子亲合色谱法来分离或提纯水蛭素。本发明人首次提出应用金属离子亲合色谱法技术来提纯水蛭素并确定了其最佳操作条件。