[发明专利]一种检测肝炎病毒核心抗原的方法

说明书

本发明属于一种检测肝炎病毒的方法，尤其是用酶联免疫微孔板法检测血清中乙型肝炎病毒核心抗原。

乙型肝炎病毒的颗粒在血液中可分为三种形态，小球形、管形及乙型肝炎病毒氏颗粒，其中乙型肝炎病毒氏颗粒是具有感染性的完整乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒氏颗粒分为核心和外壳两个部分，其中核心部分具有乙型肝炎病毒核心抗原的抗原性，众所周知，乙型肝炎病毒核心抗原是在肝细胞核中合成，到胞浆后再装配上表面抗原而成为完整的乙型肝炎病毒颗粒，再排到血液中，乙型肝炎病毒E抗原，是乙型肝炎病毒核心抗原P₁₉多肽从肝细胞入血后羟基端34个氨基酸解离后，剩下的P_15.5即乙型肝炎病毒E抗原，帮在血液中很难检测到游离的乙型肝炎病毒核心抗原，1976年用免疫粘附血球凝聚法检测血清中乙型肝炎病毒核心抗原，采用特异的家兔乙型肝炎病毒表面抗体吸附所有的乙型肝炎表面抗原，再以蛋白酶E，α-二巯基乙醇以及中性去污剂来解离蛋白外壳，使乙型肝炎病毒核心抗原释放出来，由于加入的试剂较多，且血球凝集法的敏感度要比酶联免疫测定法低很多，现使用受局限，北京医学院附属人民医院，采用抗原抗体复合物的原理，在待检标本内加入过量的乙型肝炎病毒表面抗体，形成抗原抗体免疫复合物，离心沉淀免疫复合物，再用适量的中性去污剂脱乙型肝炎病毒外壳，用固相放射免疫法检测血清中乙型肝炎病毒核心抗原，此方法虽然解决了蛋白酶E及α-二巯基乙醇的干扰因素，但此法操作步骤多，时间长，再有放射性同位素在操作上放射防护及放射性废物处理要比酶联免疫检测法麻烦很多。

本发明的目有在于提供一种用酶联免疫微孔板法简便、快速、准确地检测血清中乙型肝炎病毒核心抗原。

本发明的技术方案是：将乙型肝炎病毒表面抗体和乙型肝炎病毒核心抗体同时包被聚氯乙烯微孔板，乙型肝炎病毒表面抗体与乙型肝炎病毒氏颗粒表面抗原结合，使得乙型肝炎病毒氏颗粒被吸附在聚氯乙烯微孔板上，然后在微孔中加入中性去污剂，去污剂作用于乙型肝炎病毒壳蛋白，壳蛋白变性，乙型肝炎病毒氏颗粒壳裂解，暴露出乙型肝炎病毒核心抗原，游离的乙型肝炎病毒核心抗原被聚氯乙烯微孔板上的乙型肝炎病毒核心抗体所吸附，再在微孔中加入过氧化物酶标记的乙型肝炎病毒核心抗体过氧化物酶与加入的底物反应，最终达到检测乙型肝炎病毒核心抗原的目的。用P^H9·60·05mol/l硫酸盐缓冲液配制的乙型肝炎病毒表面抗体，乙型肝炎病毒核心抗体双抗体包被液，用P^H7·4mol/l磷酸盐缓冲液配制的乙型肝炎病毒核心抗体辣根过氧化物酶结合物，用P^H7·40·01mol/l磷酸盐缓冲液配制的2％-10％的中性去污剂，采用吐温20的洗涤液，显色液A为过氧化氢，显色液B为四甲基联苯胺，终止液采用2mol/l硫酸。

本以明的特点：简便、快速、准确，为临床上直接快速地诊断，观察及筛选乙型肝炎患者提供了更准确的检测指标。

下面详述本发明的操作步骤：

1、取100ul乙型肝炎病毒表面抗体和乙型肝炎病毒核心抗体混合液包被聚氯乙烯微孔板，放置37℃水浴箱水浴两小时，再放置4℃冰箱二十四小时，从冰箱取出，用洗涤液冲洗五次，洗净游离的表面抗体、核心抗体，拍干。

2、取100ul阴阳性对照液及待检血清标本，分别加入聚氯乙烯微孔板中，放置37℃水浴箱中水浴三十分钟，取出后用洗涤液冲洗五次以洗去血清中的核心抗体，拍干。阴阳性对照为观察和计算标本结果所用，血清标本中如存在乙型肝炎病毒氏颗粒，小球形和管形乙型肝炎表面抗原颗粒，则与聚氯乙烯微孔板上乙型肝炎病毒表面抗体结合，被吸附在固相的聚氯乙烯微孔板上。

3、取100ul5％中性去污剂和100ul乙型肝炎病毒核心抗体辣根过氧化物酶结合物同时加入微孔板中，放置37℃水浴箱中水浴三十分钟，取出后用洗涤液冲洗五次以除掉游离的乙型肝炎病毒核心抗体辣根过氧化物酶结合物，拍干。中性去污剂使得乙型肝炎病毒氏颗粒开壳，乙型肝炎病毒核心抗原暴露出来，游离的乙型肝炎表面抗原与聚氯乙烯微孔板上的乙型肝炎病毒核心抗体结合物结合，再与加入的乙型肝炎病毒核心抗体辣根过氧化物酶结合，在微孔板上形成乙型肝炎病毒核心抗体-乙型肝炎病毒核心抗原-乙型肝炎病毒核心抗体辣根过氧化物酶结合物双抗夹心状态，在微孔板中进行此反应，避免了操作步骤多而使乙型肝炎病毒核心抗原丢失影响其准确性。

4、加50ul显色液A，再加50ul显色液B，放置37℃水浴箱避免水浴十五分钟，过氧化物在有显色液A的条件下，使TMB呈蓝色反应。