[发明专利]使干扰素α-2结晶的方法

说明书

人干扰素α是一类至少包含24个亚种的蛋白(Zoon K.C.,Interferon 9:1-12,1987,Gregser I．编，AcademicPress,New York)。它们原来被描述为能够在细胞内诱导抗病毒状态的药剂，但现在被称为影响免疫系统许多功能的多效性淋巴激活素(Opdenakker等，Experimentia 45:513-520,1989)。除了其体外生物活性外，人干扰素α目前用于几种重要的指征，例如毛细胞性白血病、卡波济肉瘤、尖锐湿疣等，并正在研究将其用于其他几种指征(Intron A(干扰素α-2b)ClinicalStatus(1989))。这是从1989年9月在英国伦敦召开的第五届欧洲临床肿瘤学大会的一个附属讨论会上得来的进展。对结构的阐明及各种剂型的配制来说，最为重要的是要得到高度纯化的结晶态干扰素α，尤其是重组型α-2b。

现已报道了两种形式的结晶人干扰素α-2(Miller等，Science 215:689-690,1982；Kung等，美国专利4,672,108；Weissmsnn，“干扰素的克隆及其它错误”，Interferon 1981,Ion Gresser编，Academic Press,New York,101-134；Weissmann,Phil.Trans.R.Soc.Lond.,B299:7-28,1982；Nagabhusban等，“遗传工程α-2干扰素的定性鉴定”，Interferon:Research,Clinical Application and RegulatoryConsideration,Zoon等编，Elsevier,New York79-88,1982)。这些出版物叙述了在低温下从聚乙二醇中结晶干扰素α-2的方法，或者通过调节pH或温度而从磷酸盐缓冲液中结晶干扰素α-2的方法。通常用这些方法得到的针状结晶，用X射线衍射技术难以准确鉴定其特性。Miller等人的文章还提到了“棱状”结晶干扰素α-2。

一般来说，对干扰素这样的蛋白质进行结晶的方法是无法预言的。例如，Kung等人的美国专利4,672,108(1987)在第1栏第52-64行特别指出：

“现已建立了多种蛋白质结晶技术，但尚未发现通用的方法，因此许多蛋白质仍未结晶出来。所以，蛋白质的结晶是一门元法预言的技术，需要对许多可供选择的可能方法作反复试验。

应用最为广泛的方法之一，涉及在蛋白质溶液中加入一种结晶剂，通常是一种盐(例如硫酸铵或柠檬酸铵)或一种有机溶剂(例如乙醇或2-乙基-2,4-戊二醇)。但这些方法并未提供生产人白细胞干扰素结晶的合适手段。”(加了着重号。)

我们现已意外地发现了一种即使在室温下也能有效地产生高质量结晶干扰素α-2的方法，该方法包括：使干扰素α-2的溶液与一种硫酸盐溶液平衡，使干扰素α-2溶液变得更浓，从而形成干扰素α-2结晶。最好利用超滤法或透析法，或采用液滴(如悬滴或夹滴)来实现平衡。

干扰素α-2的溶液最好含有一种硫酸盐，并且该溶液最好与浓度更高的硫酸盐溶液平衡。该硫酸盐优选铵盐、钙盐、镉盐、钾盐、锂盐、镁盐或钠盐，更为优选的是硫酸铵。开始形成结晶时硫酸盐在结晶干扰素α-2溶液中的浓度最好为约12％至30％饱和，更为优选的是浓度为约15％至25％饱和的硫酸铵。如下面所指出的，平衡步骤开始时硫酸盐的浓度较低，即约2％至18％饱和。