[发明专利]半抗原标记的肽

说明书

本发明涉及一种产生半抗原标记肽的方法，按此方法产生的半抗原标记肽及其在免疫检测方法中的应用。

体液中，特别是人类血清中免疫球蛋白的测定用于诊断微生物感染，特别是病毒感染，例如HIV、肝炎病毒等。通常应用能与特异免疫球蛋白反应的一种或数种抗原与待检样品进行反应，以检测特异免疫球蛋白的存在。测定液体样品中特异免疫球蛋白的方法必须灵敏、可靠、简单易行且又快速。

近几年来，已经发展了越来越多的以非放射活性标记基团为基础的检测方法，在这些检测方法中，待测样品中的分析物，比如一种特异抗体，可在光学(例如发光的或荧光的)检测法、NMR-活性或金属沉淀检测方法的帮助下检测出来。

EP-A-0 307 149描述一种用两种重组多肽做为抗原的检测抗体的免疫学检测方法，其中一种多肽固定于固相上，另一种携带一个信号基团，两种多肽可在不同的菌内进行表达以提高检测的特异性。

EP-A-0 366 673中描述一种检测样品中抗体的方法。在此方法中，样品通过与纯化的标记抗原和同样纯化的与固相固定的抗原起反应来检测抗体。例如，公开了人类IgG做为一种抗原。

EP-A-0 386 713中叙述了一种应用两种固体支持物来检测抗HIV抗体的方法。在这一方法中，将不同的HIV抗原固定在这两种固体支持物上，且每种支持物都与样品及一种标记的HIV抗原相接触，这样通过至少一个实验中的阳性反应检测出抗体的存在。公开了重组产生的多肽作为HIV抗原。

EP-A-0 507 586叙述了一种检测特异免疫球蛋白的免疫学检测方法，此方法中将能与免疫球蛋白结合的两种抗原与样品相接触，第一种抗原携带一种适合与固相支持物相连接的基团，第二种抗原携带一种信号基团。信号基团可以是直接标记基团，比如一种酶、色原、金属颗粒，也可以是间接标记基团，即与抗原相连的标记基团可以与其受体相反应，而其受体携带一种产生信号的基团。提到荧光衍生物作为间接标记基团的例子，其受体是与一种酶相偶联的抗体。公开了如乙肝表面抗原一类的多肽作为抗原。通过衍生作用将SH基团导入这种抗原以与荧光剂相连。

EP-A-0 507 587描述了一种检测IgM抗体的特异方法。此方法中样品与可与待测抗体直接结合的标记抗原及可与待测抗体直接结合并能与固相相连的二抗一同孵育。

现有技术中测定抗体的免疫学方法中，通常所用的多肽抗原一般是用重组DNA的方法生产的。然而，使用此类多肽抗原时可能带来许多问题。这些重组多肽常常只能以融合多肽的形式产生，这样在检测中融合部分可导致假阳性结果。另外由重组表达产生的多肽在样品溶液中不很稳定并且易于凝聚。重组表达方法的另一个缺点是不能选择性地、可重复地将标记基团导入多肽。

此外，生产重组多肽抗原耗资高，免疫反应中大量不同的重组多肽抗原可发生大的变异。

因此，本发明的目的是提供一种产生免疫检测用抗原的简单有效的方法，本方法至少部分消除现有技术中已知抗原的缺点。另外，本方法还可选择性地、可重复地将标记基团导入抗原。

通过产生半抗原标记肽的方法达到本发明的目的，该方法具有以下特征：

(a)在固相上由其侧支反应性基团被保护基团阻断的氨基酸衍生物合成含有目标氨基酸序列的肽，选择伯氨侧支基团上的保护基团使得需要时可被选择性地裂解掉，

(b)除去保护基团以形成最少一个游离的伯氨基团，

(c)将半抗原-活性酯衍生物与肽上至少一个游离伯氨基团相偶连，并且

(d)如果需要将仍保留的保护基团裂解掉，

半抗原选自甾醇、胆酸、性激素、类皮质激素、强心甾、强心甾糖甙、蟾蜍二烯内酯、甾类皂角甙元及甾类生物碱。

根据本发明的方法产生的肽，最大长度优选50个氨基酸，特别优选30个氨基酸，它们十分适合于免疫检测方法并特别适于特异免疫球蛋白的测定。令人惊异地发现，根据本发明的方法产生的肽尽管携带着庞大的半抗原标记基团，但其对待测免疫球蛋白具有很高的亲和力和特异性。

本发明的方法能够从结合位点和数量上有选择地导入半抗原标记基团。在本发明的肽合成中，通过在氨基酸衍生物的伯氨基团上应用特定的保护基团来特异性选择肽上选择性除去保护基团后可与半抗原反应的位点，这种方法是可行的。这样就可提高检测的可重复性和敏感性。

本发明的方法的另一个优点是使用肽抗原能够测定出象IgM、IgG、IgE、IgA的所有类别抗体。这一检测方法使用所限定的小而稳定且不易凝聚的抗原，还对干扰不敏感。