[发明专利]改构的植物病毒作为异源肽的载体

说明书

本发明涉及利用病毒作为载体生产或提呈外源肽。更具体的是，本发明通过病毒核酸的遗传操作，将表达肽的外源核酸序列参入到病毒颗粒(病毒体)中。在本说明书中，“外源”这个术语当用于肽或编码的核酸时则表示它们不是作为载体的植物病毒本身的肽或核酸序列。这些序列也可称为外源性或异源性序列。“肽”这个本语包括小肽和多肽。

我们的专利申请WO92/18618，描述了利用植物病毒作为载体系统表达那些在自然界中发现的而植物病毒中不存在的外源核苷酸序列(RNA或DNA)，而且这些序列编码的肽在任何天然植物病毒中是找不到的。本发明包括含有外源肽的植物病毒颗粒的装配。因此，这里所介绍的植物病毒是天然病毒的改构形式，为方便起见称为改构病毒。

按照我们的申请WO92/18618，参入到植物病毒中的外源肽可能具有很多种类型，并且外源肽的性质和大小以及位于病毒体内或其上的部位在体外或体内培养时不能干扰改构病毒的装配能力。就广义而言，改构病毒可由任何生物学上有用的，对其活性所必需特殊构型的肽(通常为多肽)构成。为作到这一点，可将肽结合到大分子上，以此提高它在特定生物系统中的稳定性或提呈方式。这类肽的例子，象肽激素；酶类；生长因子；来源于原虫、病毒、细菌、真菌、和动物的抗原；包括抗独特型抗体在内的抗体；免疫调节剂和细胞介素，如干扰素及白细胞介素；受体；粘附蛋白；以及前面所提及的肽的部分前体。这些肽优选含有5个以上的氨基酸。

按照我们在先的发明，在植物病毒载体所提供的范围很广的生物活性肽中重点是一些与疫苗特别是动物(包括人类)病毒疫苗相关的抗原肽。应当指出，本发明中的疫苗既可用于预防(即疾病预防)又可用于治疗(即疾病治疗)。对于疫苗方面的应用，本发明提供了特别引人关注的表位提呈系统。当抗原肽成分用于疫苗时应位于病毒颗粒上如病毒外壳蛋白的暴露部位，这样易于被免疫系统所识别。因此，当应用于后者时我们的发明包括改构植物病毒颗粒的装配，它们含有来自病原体如动物病毒的抗原，这类抗原参入到植物病毒外壳蛋白表面的暴露部位。本发明还包括用这类装配的改构植物病毒颗粒作为疫苗的免疫原成分。这种可提供抗原肽的改构病毒也可用作免疫诊断的抗原提呈成分用于检测动物(包括人类的)致病原或疾病。

我们在先的专利申请所描述的系统可将不同大小的外源肽插入到病毒外壳蛋白中。因此，在我们继续的研究过程中已成功地插入含有38个或更多氨基酸的多肽。但是，这样产生的非天然结构的改构病毒的缺点，是在植物中增殖时与未改构病毒(野生型)发生竞争。作为结果，我们已观察到一些改构病毒在增殖期间有外源肽丢失的倾向，这样改构病毒的产率就降低。

根据本发明，对此问题的原因已经查明，并且制定了防止产生这种情况的必要措施。

首先，在将编码外源肽的核苷酸序列导入植物病毒核酸的过程，应避免插入片段两侧存在直接重复序列。在本发明中，含有直接重复序列的构建物就是在被插入片段两侧存在的相同的寡核苷酸序列。这类构建物在遗传学上是不稳定的，因为在重复序列之间可发生重组而导致外源肽编码序列的丢失，并回复成野生型序列。第二，在外源寡核苷酸序列插入到植物病毒基因组中取代其部分已存在的序列时，产生的改构病毒外壳蛋白可能失去对病毒在植物中复制、衣壳化及传播起重要作用的氨基酸序列。这种缺点是容易确定的并且可以避免。第三，异源序列不应插入在亚适位点。

本发明包括含有外源肽的植物病毒颗粒的装配，其中相应外源核酸已被插入到植物病毒基因组中，在插入序列两侧不存在直接重复序列，并且作为该核酸的附加物。

在一项优选的实施方案中植物病毒是豇豆花叶病病毒(CPMV)并且使外源插入序列直接位于小外壳蛋白(VP23)的βB-βC环中的脯氨酸23(Pro²³)之前。

本发明可用于已明确编码外壳蛋白暴露部分的病毒基因组的任何植物病毒。在这部分基因组内选择两个不同的限制酶位点并用相应的限制酶进行裂解。合成互补的寡核苷酸对，其两者末端之间的序列编码所需的插入到病毒外壳蛋白中的外源肽。寡核苷酸的末端具有匹配的限制酶位点，因此可将外源序列插入到裂解的病毒核酸中。这种方法可将编码外源肽的核苷酸序列导入并可避免插入片段两侧存在直接的重复序列。优选在合成的互补寡核苷酸中编码异源氨基酸的序列两侧是植物病毒特异序列，这样外源核酸的插入即作为已存在的病毒核酸的附加物。