[发明专利]血栓溶解酶及其制备方法

说明书

本发明的领域

本发明涉及医学领域中的止血术、药理学，在临床和实验药物上用于作为血栓溶解生物活性制剂。

已有文献

目前对医用水蛭唾液腺分泌物的应用停留在一系列作为用于制备具有血栓溶解、纤维蛋白溶解活性的生物活性物质的各种源物质上，这些源物质仍在补充之中。对作为生物活性物质源物质的医用水蛭的天然分泌物的实际兴趣是由于在水蛭疗法的水蛭吸血法中使用医用水蛭的血栓溶解效应时，确定了由不同病因引起的血栓性静脉炎的治疗效应的依赖性(Zaitsev G.B.“血栓静脉炎”，1947，Medgiz，莫斯科，p.78)。

医用水蛭唾液腺分泌物的应用是由于发现了转变为新性质的新的机理。

当用酪蛋白和非稳定的纤维蛋白作为底物时，分析医用水蛭唾液腺分泌物的性能表明它几乎不具有蛋白水解活性。然而，当医用水蛭唾液腺分泌物在与交联着因子XIIIa的不溶性稳定纤维蛋白的温育过程中，纤维蛋白能转变成可溶性状态，并且纤维蛋白的稳定程度越高(即在稳定的纤维蛋白制备物中存在较多的ε-(γ-Glu)-Lys-异肽键)，转变的程度就越大。这个初看起来不合理的见解，我们解释为是由于在水蛭分泌物的组成中存在一种酶，该酶特别地水解稳定化纤维蛋白中的异肽键，而对不存在这些异肽键的非稳定化纤维蛋白不起作用。这种酶称为去稳定酶(destabilase)(Biokhimiya，50，1985，Nauka，莫斯科，pp.424-431)。

已知的溶解血栓和溶解纤维蛋白的酶对纤维蛋白中肽键的水解有催化作用，与具有ε-(γ-Glu)-Lys-异肽键的“交联”纤维蛋白的程度无关，所述的异肽键是由于转肽酶、因子XIIIa的作用形成的。通常，与非稳定的纤维蛋白相比，与异肽键“交联”的或稳定化的纤维蛋白更能耐受蛋白水解酶的影响。同时，非稳定纤维蛋白能变成可溶状态，这不仅是由于纤维蛋白溶解酶刺激的蛋白水解作用的结果，也是非特异性试剂作用的结果，这些非特异性试剂会削弱纤维蛋白单体之间的离子性的、疏水性和H-O-的相互作用。

本发明的描述

本发明揭示了一种物质、它的性能以及制备能溶解血栓，并与按分子量和氨基酸序列从医用水蛭获得的已知制剂不同的，具有酰胺分解作用的外切异肽酶和内切异肽酶活性的血栓溶解酶的方法。

所述制备去稳定酶的方法按下述方式进行。

将医用水蛭的提取液进行亲合色谱处理，所述色谱是在含有固定在琼脂糖凝胶(sepharose)4B上针对去稳定酶的抗体柱上进行的。柱由0.02M的tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)平衡。未交联的蛋白质用缓冲液洗涤，而去稳定酶用含0.3MNaCl的同样缓冲液洗脱。所得的制剂再次在含CM-三丙烯酸类吸着剂、用0.02Mtris-HCl缓冲液(pH＝7.4)平衡的柱上进行色谱处理。所需产物用溶解在同样0.02Mtris-HCl缓冲液中的0.05M-0.20M NaCl洗脱。收集含最终产物的组分，在Superose-12上凝胶过滤进行脱盐，冷冻干燥。结果，所得的制剂含100％的活性物质。纯度用电泳法加以确定。

基本结构。为了鉴定基本结构，在含Aquapore RP-300(4.6×100)的反相柱上以0-60％的乙腈梯度，对酶进行色谱处理60分钟。确定了去稳定酶的N-末端序列。确定了苏氨酸为N-末端氨基酸。然后进行去稳定酶的溴化氰(CNBr)水解，所得的混合物再次在同样的柱上在同样的条件下进行色谱处理。结果获得了四个肽片断。确定了第一片断的氨基酸序列，它由25个氨基酸残基组成，且在NH₂-末端含有苏氨酸残基：Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Arg Cye IleCys Gln Val Glu Gly Cys Asn Asn Glu Ile Gly Arg Cys Gly Met.

对第二片断，确定了来自N-末端的，在NH₂-末端为天冬氨酸的28个氨基酸序列：Asp Ala Gly Ser Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Gln Ile Lys Glu Pro Tyr X Ile AspX Gly Arg Pro Gly Gly X Tyr Gln。

对第三片断，确定了来自N-末端的，在NH₂-末端为天冬氨酸的24个氨基酸残基的氨基酸序列：Asp Arg Tyr Ala Pro Pro Cys Thr Gly Gly Arg Gln Pro ThrCys Gln Asp Tyr Ala Lys Ile His Asn Met。