[发明专利]高分辨图谱的做图方法及图谱探针

说明书

                      致谢

本发明部分是在政府部门的支持下完成的，能源部(Department of Energy)的许可号为DE-FG603-92ER-61402，而国有健康人类基因组创始研究所(NationalInstitutes of Health Human Genome Initiative)的许可号为R29HG00037-04。政府对本发明享有一定的权利。

                        发明背景

本发明涉及用以鉴定与人疾病有关的基因的方法及试剂。本发明还涉及整个人基因组的高分辨遗传图的构建。

本申请中的各种文献均注明在括号里。这些文献公开的内容以其全文引入本申请作为参考，以便对与本发明相关的技术领域的状况作更全面的描述。

                         发明背景

由人类基因组工程(Human Genome Project)提供的资源正形成用来鉴定造成人类疾病的50-100,000个基因的策略。当前用高度多态的标记来快速和廉价地定位造成遗传疾病的基因的种种努力(Weissenbach，J.等，Nature359：794-801，1992)已超过将可得到的标记与目前已知的10,000或更多的人cDNA联系起来的能力。目前已克隆了预计全部约50,000-100,000人基因中的近20,000个片段，并部分已被测序。虽然有了这些成功，仅约3000个这样的克隆被定位到它们各自的染色体位点上，大部分定位于包括多条带的10-20Mb大的区域。因此，不能将染色体上均匀间隔的提供大量信息的标记鉴定出来导致了当前做图技术的明显的弱点。

物理图谱技术对遗传连锁提供了补充。例如，标准的琼脂糖凝胶电泳的分辨率的范围为1到10Kb。脉冲场技术使该范围延伸至兆碱基的水平。然而，凝胶电泳技术对于以前没有被定过位的DNA序列的初始定位是无用的。而且，这些方法不具备使相差多于几十万对碱基的DNA序列排序的能力，也不具备使DNA序列分配到特定染色体区域的能力。

染色体显带技术使特定的人染色体的识别变得容易半且提供了诊断染色体异常的主要依据。最初的染色体分配和基因定位，已使用了几种技术来获得高度精确的定位。然而这些技术具有一些不利的方面。例如，部分依赖于在UV辐射后DNA丢失的显带技术会因此导致某些信号的丢失(Cherif等，Proc.Natl.Acad.SciUSA87：6639-6643(1990)；和Takahashi等，Hum.Genet86：14-16(1990))。与其它技术相比，标准的DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，或PI(碘化锭)染色产生不一致的图谱，并且通常分辨率较低(Pinkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：2934-2938(1986)；Lemieux等，Cytogenet Cell Genet.59：311-312(1992)；Yamada等，Genomics15：449-452(1993)；及Heng等，Chromosoma102：325-332(1993))。其它技术产生强的好区分的图谱，适于强信号大探针的探测，但会模糊由小探针产生的微弱信号(Rowley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：9358-9362(1990))。最后，杂交后的吉姆萨染色，是其它染色技术的典型，必须经两轮的微观评价，一轮测杂交探针而另一轮定位信号到显带的染色体上(Klever等，Hum.Genet.86：484-486(1991))。使用分散的重复序列的同时杂交方法也可用于标记带(Baldini等，Genomics9：770-774(1991))，但经常证明难以获得既显示清晰的带图谱又显示由小探针产生的杂交信号的中期带图。

鉴定人DNA片段在染色体上座位的最直接的方法是原位杂交。虽然小于1Kb长的单一序列可用同位素标记的探针来定位，但放射自显影的显影时间长(经常数周或数月)，需要大量的统计分析，并且图谱的精确性被为捕获放射的同位素信号而必须用感光乳胶剂覆盖所限制。相反，非同位素标记的探针，虽在速度和空间分辨方面得到了改进，但敏感性差。

因此，虽然已描述了许多的染色体带分配技术，但这些现有技术均有弊端。例如，大多数的现有技术的分辨率比标准的吉姆萨显带要低，使用的荧光染料的光谱与标准FISH标记重叠，导致DNA的丢失，或仅被使用于插入到粘粒或噬菌体载体中的大基因组探针。