[发明专利]乳头状瘤病毒疫苗无效

专利信息
申请号: 95194158.5 申请日: 1995-05-15
公开(公告)号: CN1152935A 公开(公告)日: 1997-06-25
发明(设计)人: K·U·扬森;J·C·库克三世;H·A·乔治;K·J·霍夫曼;J·G·乔伊斯;E·D·莱曼;H·Z·马卡斯;M·罗索洛斯基;L·D·舒尔茨 申请(专利权)人: 麦克公司
主分类号: C12N7/00 分类号: C12N7/00;C12N7/02;C12N7/04;C12N15/17;C12N15/81
代理公司: 中国专利代理(香港)有限公司 代理人: 罗宏,姜建成
地址: 美国新*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 乳头状 病毒 疫苗
【说明书】:

其它相关申请

这是现在未决的,1994年5月16日提交的U.S.S.N.08/242794的后续部分。

发明领域

本文提供编码乳头状瘤病毒L1和L2蛋白的重组表达载体,制造重组蛋白的方法和使用重组蛋白的方法。

发明背景

乳头状瘤病毒感染在许多动物中发生,包括人类,绵羊,狗,猫,兔,猴,蛇和母牛。乳头状瘤病毒感染上皮细胞,通常在感染位点诱导良性上皮和纤维上皮肿瘤。乳头状瘤病毒是种特异性感染因子,人类乳头状瘤病毒不能感染非人类动物。

基于乳头状瘤病毒感染的宿主可将它们分为不同的组。基于DNA序列同源性可将人类乳头状瘤病毒(HPV)进一步分为60型以上(参见综述:乳头状瘤病毒和人类癌症,H.Pfister(编),CRC Press,Inc.,1990)。乳头状瘤病毒型表现为型特异性免疫原,因为对某一型乳头状瘤病毒感染的中和免疫性不授予针对另一型乳头状瘤病毒的免疫性。

在人类中,不同HPV型引起不同疾病。HPV型1,2,3,4,7,10和26-29在正常和免疫妥协个体两者中引起良性疣。HPV型5,8,9,12,14,15,17,19-25,36和46-50在免疫逃逸个体引起扁平损害。HPV型6,11,34,39,41-44和51-55引起生殖器或呼吸粘膜的非恶性湿疣。HPV型16和18引起生殖器粘膜的上皮发育不良并与多数宫颈,阴道,外阴和肛管的原位和侵袭性癌有关。HPV6和HPV11是90%以上的湿疣(生殖器疣)和喉乳头状瘤的致病因子。HPV6型的最大量的亚型为HPV6a。

在动物中的免疫学研究显示针对乳头状瘤病毒抗原的中和抗体的产生防止同源病毒的感染。由于乳头状瘤病毒体外培养困难,有效的乳头状瘤病毒疫苗进展很慢。由于缺乏适当的动物模型,有效HPV疫苗的发展特别缓慢。

抗体对乳头状瘤病毒的中和表现为型特异性并依赖于病毒表面的构象表位。

乳头状瘤病毒是编码达8个早基因和两个晚基因的小(50-60nm),无包膜,二十面体DNA病毒。病毒基因组的开放阅读框(ORFs)称为E1至E7和L1和L2,其中“E”指早而“L”指晚。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早(E)基因与病毒功能如病毒复制和细胞转化相关。

L1蛋白是主要衣壳蛋白并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要衣壳蛋白,它具有55-60kDa的预期分子量和经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的75-100kDa的表观分子量。免疫学资料提示L2蛋白的大部位于L1蛋白之内。L2蛋白在不同的乳头状瘤病毒中是高度保守的,特别是C末端的10个碱性氨基酸。L1ORF在不同乳头状瘤病毒中是高度保守的。

L1和L2基因已被用于产生用于防止和治疗动物中乳头状瘤病毒感染的疫苗。Zhou等(1991;1992)将HPV型16L1和L2基因克隆入牛痘病毒载体并用重组载体感染CV-1哺乳类细胞以产生病毒样颗粒(VLP)。

细菌衍生的重组牛乳头状瘤病毒L1和L2已被产生。对重组细菌蛋白的中和血清与天然病毒在低水平交叉反应,可能是由于天然的和细菌衍生的蛋白构象的不同。表达HPV6L1,HPV11L1,HPV16L1,HPV18L1,HPV31L1或HPV16L2 ORF的重组棒病毒(baculovirus)已被用于感染昆虫SF9细胞并产生L1和L2蛋白。Western印迹测定显示棒病毒衍生的L1和L2蛋白与针对HPV16的抗体反应。棒病毒衍生的L1形成VLPs。

Carter等(1991)证实HPV16L1和HPV16L2蛋白由酿酒酵母的重组株产生。Carter等还证实了HPV6bL1和L2蛋白的产生。该HPV6bL1蛋白不是全长L1蛋白。重组蛋白作为细胞内的或分泌的产物产生。重组L1和L2蛋白分子量近似于天然蛋白。当蛋白在细胞内表达时,发现当在不存在变性剂情况下细胞被溶胞时大多数蛋白不可溶。虽然这种不溶性可易化蛋白的提纯,它可妨碍蛋白天然表位的分析。

从酵母分泌的重组蛋白显示含有酵母衍生的碳水化合物。这些N-连接的寡糖的存在可掩藏天然表位。另外,分泌的重组蛋白可含有其它修饰,如持有分泌前导序列。

建立通过重组酵母的培养大量生产任何种型的乳头状瘤病毒蛋白的方法将是有用的。产生大量的具有天然蛋白的免疫授予特性,如天然蛋白的构象的乳头状瘤病毒蛋白也将是有用的。

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