[发明专利]超热稳定蛋白酶基因

说明书

                    发明领域

本发明涉及一种编码用于工业用途的超热稳定的蛋白酶的基因以及用基因工程方法生产该酶的方法。

                    发明背景

蛋白酶是可以裂解蛋白质中肽键的酶并且已经在动物、植物和微生物中发现了各种蛋白酶。它们不仅被用作研究工作和医疗用品的试剂，而且还在工业领域中被用作如洗涤剂、食品加工和利用其逆反应的化学合成中的添加剂，并且从工业角度看它们可以说是很重要的酶。对用于工业领域的蛋白酶来说，由于要求很高的物理和化学稳定性，因此特别优选使用具有高的热稳定性的酶。目前，在工业领域中主要使用的是产自芽胞杆菌属细菌的蛋白酶，因为它们具有相对高的热稳定性。

但是，仍需要具有更进一步的优良性状的酶，并且已试图从可在高温下生长的微生物和芽胞杆菌属的嗜热菌中获取酶。

另一方面，一种称为超嗜热菌(hyperthermophiles)的微生物很适于高温环境，因此它们被希望成为提供各种热稳定酶的来源。已知这些超嗜热菌的一种，Pyrococcus furiosus，可产生蛋白酶[应用与环境微生物学，56，1992-1998(1990)；欧洲微生物学联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Letters)，71，17-20(1990)；普通微生物学杂志，137，1193-1199(1991)]。

另外，对Thermococcus，Staphylothermus和Thermobacteroides属的超嗜热菌来说，也已知其是产蛋白酶的[应用微生物学和生物工程学，34，715-719，(1991)]。

                    发明目的

因为这些超嗜热菌所产的蛋白酶具有高的热稳定性，它们被期望可用于其它任何已知的酶未曾用到过的新的应用中。但是，上述的公开仅仅说明热稳定的蛋白酶活性存在于无细胞提取物中或来自培养上清的粗酶溶液中，没有关于分离纯化的酶性质等的公开。而且，因为为了从这些超嗜热菌中获取酶，必需在高温下培养微生物，所以在这些酶的工业生产中仍存在问题。为了解决上述的问题，本发明的一个目的就是分离一种编码一种超嗜热菌的蛋白酶的基因。本发明的另一个目的是提供一种通过使用该基因的遗传工程方法而制备该蛋白酶的方法。

                  发明公开

为了获取超热稳定的蛋白酶基因，本发明人试图从Pyrococcus furiousDSM 3638的微生物细胞和培养上清中纯化一种蛋白酶以便独立地确定该酶的部分氨基酸序列。但是，无论使用微生物细胞或培养上清，纯化该蛋白酶都是十分困难的，并且本发明人未能获得具有足够纯度的用于确定其部分氨基酸序列的酶样品。

作为一种克隆无任何关于该酶的一级结构信息的目标酶的基因的方法，存在一种表达克隆的方法，例如，根据这种方法获取了源自PyrococcusWoesei的支链淀粉酶基因(WO92/02614)。但是，在表达克隆方法中，通常使用质粒载体并且，在这种情况下，必须使用可将目标基因切割为相对小的DNA片段的限制酶，以便在不切割目标基因任何内部位点的情况下将片段插入质粒载体中。并且该方法并不是对克隆各种酶基因都是可用的。而且，必须检测大量克隆的酶活性，而该操作是很复杂的。

本发明人已尝试通过使用柯斯质粒载体并研究文库中的柯斯质粒克隆来找出表达蛋白酶活性的克隆而分离蛋白酶基因，其中柯斯质粒载体能替代质粒载体保持大的DNA片段(30-50kb)以制备Pyrococcusfuriosus基因组的柯斯质粒文库。通过使用柯斯质粒载体，除降低了该酶基因内部位点的裂解可能性之外，减少了需要筛选的转化体的个数。另一方面，由于柯斯质粒载体在宿主中的拷贝不如质粒载体的高，可能会使所表达的酶的量太少而不足以检测其酶活。

从目标酶的高的热稳定性来看，首先本发明人已分别培养了柯斯质粒文库中独立的转化体，并且将该步骤与制备仅含来自由此得到的微生物细胞的热稳定蛋白的溶胞产物的步骤结合起来。这一组溶胞产物被称为柯斯质粒蛋白文库。通过在检测酶活性中使用柯斯质粒蛋白文库，检测敏感性比使用转化体克隆的方法得到了提高。

另外，本发明通过用含明胶的凝胶进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳而使对痕量酶活性的检测成为可能。根据该方法，可高敏感性地检测浓缩在凝胶中的一条带的样品中的痕量蛋白酶活性。