[发明专利]从细菌中提取异源不溶性蛋白质

说明书

发明背景

以含有编码哺乳动物蛋白质的DNA序列的载体转化细菌是常用的方法。用细菌表达哺乳动物蛋白质，可得到高产量的这种蛋白质，它包含在细菌的包涵体内。为了得到并纯化这种蛋白质，必须从细菌中提取出含有蛋白质的包涵体。

在过去，分离包涵体的方法是通过离心发酵液体培养基(fermentation broth)，除去上清，将细菌沉淀物重悬在缓冲液中，然后用机械方法，如均质化处理或超声处理，或者，用溶菌酶加去圬剂处理，使细菌细胞裂解。再将含有裂解细菌细胞的混合物离心，得到上清液和包涵体沉淀。包涵体沉淀物，是对细菌细胞体裂解和离心处理后得到的含有包涵体的沉淀。但是，这种处理方法包括离心含有活细菌发酵液体培养基的第一步操作。在大批量的离心过程中，活细菌常常会以气溶胶的形式被离心发散到周围的空气中。

美国专利4,958,007通过在发酵液体培养基中加入甲苯或酸来首先使细菌灭活而解决了这个问题。然后将此培养基离心，除去上清液，将细菌沉淀物重悬在缓冲液中，并调整此悬液的pH，使最终pH为6-9。换句话说，就是将被酸化的发酵液体培养基的pH，调整到6-9。然后通过均质化处理使细菌细胞裂解，从细胞中释放出包涵体。这种方法避免了在离心过程中活细菌发散到空气中；但是，如果使用甲苯灭活细菌，这种方法必须在防爆炸的房间内操作，因为甲苯是易燃性的，它的气雾会引起爆炸。而且，如果用酸灭活细菌，细菌沉淀物重悬于缓冲液中，再将悬液的pH调整至最终pH为6-9，这样，会使原来可溶性的细菌蛋白质变成不溶性的，结果导致包涵体沉淀中含有不可接受的高浓度宿主细菌蛋白质。

因此，有必要对提取不溶性重组蛋白质的方法进行改进，改进的方法应该在离心之前就杀灭全部或绝大部分细菌，绝大部分宿主细菌蛋白质应保留在溶液中，占绝对优势的不溶性蛋白质应该是细菌表达的异源性蛋白质。发明概述

本发明通过当细菌尚存在于发酵液体培养基中时，裂解这种表达异源性蛋白质的细菌，随后可任选地用酸处理灭活细菌，来满足上述改进要求。然后可以在不发散活菌的状态下进行离心。这种对细菌的裂解处理，显著地降低了活菌的数量，并且可以在密闭系统中进行操作，使含有活菌的液体培养基的发散降到最小程度，或者完全消除。用本发明方法获得的包涵体含有更高纯度的异源性蛋白质，也就是说与按用现有的技术提取得到的包涵体相比较，这种包涵体含有更低浓度的不溶性细菌蛋白质。

本发明提供了三种从表达异源性蛋白质的细菌中提取含有异源性蛋白质的包涵体的方法。

第一个实施方案包括如下步骤：

(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；

(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；

(c)离心该发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；

(d)除去上清液，得到包涵体沉淀。

本发明的第二个实施方案包括如下步骤：

(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；

(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；

(c)在0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；

(d)向已均质化处理的发酵液体培养基加入酸，使其pH达到大约2.0；

(e)在0-15℃的温度下温育被酸化的发酵液体培养基，以便杀灭所有残存的未被裂解的细菌；

(f)离心该发酵液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；

(g)从包涵体沉淀物中除去上清液；

(h)将此包涵体沉淀悬浮在缓冲液中，得到悬浮液；

(i)将pH调整液加入到该悬浮液中，使悬浮液的pH达到6-9；

(j)裂解在步骤(i)的悬浮液中包含的悬浮固体；

(k)离心该悬浮液，得到含有异源性蛋白质的包涵体沉淀和上清液；

(l)除去上清液，得到被分离出的含有异源性蛋白质的包涵体。

本发明的第三个实施方案包括如下步骤：

(a)在发酵液体培养基中发酵表达异源不溶性蛋白质的细菌；

(b)裂解包含在发酵液体培养基中的细菌；

(c)在0-15℃的温度下冷却或保持该发酵液体培养基；

(d)将硝酸加入到该发酵液体培养基中，使其pH达到约2.0；

(e)在大约0-15℃的温度下培育这种酸化的发酵液体培养基，以便杀灭细菌；

(f)使该液体培养基的pH上升到大约8.5；

(g)对此液体培养基作裂解处理；

(h)离心已裂解的液体培养基，得到包涵体沉淀和上清液；