[发明专利]核酸序列专一性结合寡聚体及其在反义方法中的用途

说明书

本发明涉及具有核酸结合特性的寡聚体，该寡聚体是完全或部分地以1，5-失水己糖醇核苷类似物为单体单元构成。本发明还涉及将这种寡聚体用于反义技术中的用途，以及制备这种寡聚体的方法。

反义技术基于这样的原理：DNA或RNA分子编码有义链的功能可以被一个互补的反义链封阻。反义技术可用于各种用途，如诊断、治疗、DNA修饰和分离等。在这些技术中，除了反义链自身的稳定性很重要以外，由所述有义链和反义链所形成的双链体或三链体的稳定性以及反义链与有义链的结合力也很重要。同样，所述寡聚体、双链体或三链体对降解酶，如核酸酶的敏感性也是一个与其有效性相关的因素。

寡核苷酸是单体为核苷酸的寡聚体。核苷酸是核苷的磷酸酯，核苷由一个嘌呤或嘧啶碱和一个糖组成。每个核苷酸的主链由交替的糖基和磷酸基组成。

核苷酸的稳定性和结合力举例来说可受碱基修饰的影响。对此进行的研究(1-5)表明，这种修饰仅能导致出现稳定性较差的双链体。改变主链或是将新的结构插入主链确实能提高核酸酶稳定性，但是，仅能对其与互补链的结合力产生不利影响。对糖进行修饰只能有限地提高其对靶分子的亲和力(6-8)。

本发明的目的在于提供新的寡聚体，与已知寡聚体相比，这种寡聚体具有较高的稳定性和结合力。

业已发现，完全或部分地由1，5-脱水-2，3-双脱氧-D-阿糖基-己糖醇核苷类似物组成的寡聚体(其中，己糖醇通过其2-位与嘧啶或嘌呤碱的杂环连接)，能够同天然寡核苷酸结合。至少部分地构成寡聚体的单体由式I表示：其中，B是一个杂环，它由嘧啶或嘌呤碱衍生而来。所述单体通过磷酸二酯键相互连接在一起，这种寡聚体的结构如式II所示：其中，B是一个由嘧啶或嘌呤碱衍生而来的杂环，l是0-15的一个整数，k和m各自为1～15的一个整数，但是，如果k＞1，则m可以为0，而如果m＞1，则k可以为0；而且，其中X表示氧或硫。本发明包括式II化合物的所有可能的盐。式I的单体是欧洲专利申请No.92201803.1的主题。式II的寡聚体是一种新的化合物。它具有与由天然2’-脱氧核苷组成的寡核苷酸类似的一些特性，但其单体的糖被增大了，因为在环的氧化物和与碱基连接的碳原子之间插入了亚甲基。

根据本发明，业已发现式II的寡聚体及其盐表现出结合式III所示天然寡核苷酸的序列专一性：其中，k是一个整数，而B的定义与在式I和II中的相同。因此，发现一类新的hybridons或序列专一性结合聚合体。

至少部分地由吡喃糖核苷组成的本发明寡聚体具有较高结合力的事实是十分惊人的。在过去几年中，由Eschenmoser等组成的科研小组一直致力于研究由单体吡喃糖核苷酸组成的寡核苷酸。Eschenmoser研究了呋喃糖作为核酸的糖结构单元的自然选择(9)。然而，他并未指出为实现与天然呋喃糖-DNA的良好结合需要合适的反义分子。

不过，本发明人证实，类吡喃糖寡核苷酸能够同天然呋喃糖-DNA形成稳定的双链体(10，11)。理论上讲，吡喃糖寡核苷酸具有优于呋喃糖寡聚体的自由能，因为其在双链体形成中熵变较少。

然而，本发明人先前所研究的类吡喃糖寡核苷酸不能够或不能充分地结合天然呋喃糖-DNA互补链。所述类吡喃糖寡核苷酸分别由2，3-双脱氧-β-D-红-吡喃己糖核苷(式V)、2，4-双脱氧-β-D-红-吡喃己糖核苷(式VI)和/或3，4-双脱氧-β-D-红-吡喃己糖核苷(式VII)组成。

更为惊人的是，发现包含吡喃糖作为糖结构单元的式II寡聚体具有序列专一性结合能力。将呋喃糖化合物的呋喃环放大成吡喃环，并不会产生能够同天然寡核苷酸结合的寡聚体。因此，不能期望把呋喃戊糖环放大成1，5-失水己糖醇环。

因此，本发明的化合物是核苷类似物的寡聚体，其中，1，5-脱水-2，3-双脱氧-D-己糖醇是按照阿糖基-构型通过2-位同一个嘧啶或嘌呤碱的杂环连接。

由上述核苷类似物以磷酸二酯或硫代磷酸二酯形式相互连接组成所述寡聚体。该寡聚体可用式II表示，其中，k、l、m、B和X具有以上定义。该寡聚体可以仅由式I的己糖醇核苷类似物组成(其中，式II里的l等于0)，或间隔插入天然2’-脱氧核苷，或将其连接在该分子的末端(其中，式II里的l等于或大于1)。所述己糖醇具有(D)-构型，而其取代基的立体化学符合阿糖基构型。