[发明专利]用于微生物学实验室日常诊断中迅速检测和鉴别临床样品中普通细菌病原体和抗生素抗性基因之特异性和通用性探针及扩增引物

权利要求书

1.一种在怀疑包含有细菌核酸的任何样品中使用探针(片段和/或寡核苷酸)和/或扩增引物的方法，所述探针和/或扩增引物对检测核酸的存在和/或其量而言是特异的、普遍的和敏感的，所述核酸得自选自下组的细菌物种：大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、奇异变形菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、腐生葡萄球菌、酿脓链球菌、流感嗜血菌和粘膜炎莫拉氏菌，其中所说的细菌核酸或其变体或部分包含可与所说的探针或引物杂交的选择的靶区，该方法包括以下步骤：使所说的样品与所述的探针或引物接触，并检测指示所说的任何细菌物种的存在和/或其量的杂交探针或扩增产物的存在和/或其量。

2.一种如权利要求1限定的方法，该方法是在怀疑包含有细菌核酸的任何样品中使用探针(片段和/或寡核苷酸)和/或扩增引物的方法，所述探针和/或扩增引物对检测任何细菌核酸的存在和/或其量而言是通用的和敏感的，其中所说的核酸或其变体或部分包含可与所说的探针或引物杂交的选择的靶区，该方法包括以下步骤：使所说的样品与所述的探针或引物接触，并检测指示所说的任何细菌的存在和/或其量的杂交探针或扩增产物的存在和/或其量。

3.一种如权利要求1限定的方法，该方法是在怀疑包含有细菌核酸的任何样品中使用探针(片段和/或寡核苷酸)和/或扩增引物的方法，所述探针和/或扩增引物对检测核酸的存在和/或其量而言是特异的、普遍的和敏感的，所说的核酸得自选自下组抗生素抗性基因：bla_tem、bla_rob、bla_shv、aadB、aacC1、aacC2、aacC3、aacA4、mecA、vanA-vanH-vanX、satA、aacA-aphD、vat、vga、msrA、sul和int。其中所说的核酸或其变体或部分包含可与所说的探针或引物杂交的选择的靶区，该方法包括以下步骤：使所说的样品与所述的探针或引物接触，并检测指示所说的抗生素抗性基因的存在和/或其量的杂交探针或扩增产物的存在和/或其量。

4.权利要求1、2和3任一之方法，该方法在从人类患者、动物、环境或食品获得的样品上直接进行。

5.权利要求1、2和3任一之方法，该方法在由一个或多个细菌菌落组成的样品上直接进行。

6.权利要求1至5任一之方法，其中所说的细菌核酸由选自下组的方法扩增：

a)聚合酶链反应(PCR)，

b)连接酶链反应，

c)基于核酸序列的扩增，

d)自动维持序列复制，

e)链置换扩增，

f)分支DNA信号扩增，

g)嵌套式PCR，和

h)多重PCR。

7.权利要求6的方法，其中由PCR扩增所说的核酸。

8.权利要求7的方法，其中所说的PCR方案被修改来在一个小时内测定出所说核酸的存在，该方案通过对各扩增循环进行55℃下仅1秒钟的退火步骤和95℃下仅一秒钟的变性步骤，而不进行任何延伸步骤。

9.一种用于直接从试验样品或从细菌菌落检测、鉴别和/或定量分析大肠杆菌的方法，该方法包括以下步骤：

a)将样品的或从这一样品分离的实质上均一的细菌群体的细菌DNA沉积和固定在惰性支持物上或保留在溶液中，或者

将所说的样品或从这一样品分离的实质上均一的细菌群体接种到惰性支持物上，并原位溶解所说的接种的样品或分离的细菌，以释放细菌DNA，

所说细菌DNA实质上是单链形式；

b)在可以使探针核苷酸与所说细菌DNA选择性杂交的条件下，把所说的单链DNA与探针接触，从而形成杂交复合物，所说的探针包含至少一种单链核酸，该核酸的核苷酸序列选自下组：SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、其互补序列、其部分和其变体，所说探针特异性地和普遍地退火结合到大肠杆菌菌株或代表物上，所说的复合物由标记方法检测，标记存在于所说探针上或者标记存在于所说标记方法的第一反应成员上，所说第一反应成员与存在于所说探针上的第二反应成员反应；以及

c)检测在所说惰性支持物上或在所说溶液中的指示所说样品中大肠杆菌的存在和/或其量之所说标记的存在或其强度。