[发明专利]用于医疗诊断的微凝胶及其制造方法和使用方法

说明书

发明背景

本发明涉及用于医疗诊断，尤其是用于核酸测序的微凝胶，以及这类凝胶的制造和使用方法。

DNA测序可以利用为实验室使用而设计的自动化系统来进行。在此引用参考的美国专利4,811,218；4,823,007；5,062,942；5,091,652；5,119,316和5,122,345中，描述了用于DNA测序的方法和装置。

这些系统中的一般方法涉及，利用限制性内切核酸酶断裂样品DNA；扩增有关的限制性片段(例如利用PCR)；将扩增后的DNA与测序引物混合，该引物可以与扩增引物相同或不相同；在一般核苷酸(A，C，G和T)和可防止引物被过度延伸的链终止核苷酸例如双脱氧核苷酸存在的条件下，对测序引物进行延伸；分析所得延伸片段产物的长度。该分析可以通过电泳进行，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳。

国际专利申请WO93/00986描述了厚25至250微米的电泳凝胶。这些凝胶形成于两块夹板之间，在其中一块板上开槽形成平行的凹道(其深度等于要求的凝胶厚度)，然后在这些凹道中充以凝胶。

在凝胶上进行核酸测序分析，包括大小和厚度在内的凝胶特性影响着分析所需的时间和花费。由于人们希望能减少测序分析所需的时间和花费使之成为一种诊断手段，所以较好的是有一种凝胶，它能够进行很少量寡聚核苷酸片段的快速分析。本发明的目的之一就是提供这样的凝胶。

本发明目的之二是提供单用途的一次性凝胶盒，可以方便地在其中充以凝胶作快速分析少量样品之用。

本发明目的之三是提供一种制造凝胶的方法，该凝胶能够在短时间内获得对寡聚核苷酸片段很高的分辨力。

本发明目的之四是提供分析含有不同长度寡聚核苷酸片段的样品的方法。

发明概述

本发明的以上目的及其它目的可使用在一凝胶盒中形成的电泳微凝胶来达到。该凝胶盒有一盖板，一底板和位于盖板和底板之间的隔离片。隔离片在盖板和底板之间形成250微米以下的间隔，以25至250微米为佳。将盖板部分密封至底板，留下一个引入未聚合凝胶的开口，由此形成凝胶室。然后在凝胶室中充以未聚合或部分聚合的凝胶，这种凝胶然后在凝胶室中聚合。电极可以印刷在板上、可以令其与凝胶的露出边缘接触，或者可以通过开在一块板上的窗口来插入。

本发明一种较好的实施方式使用了直径250微米以下，以25至250微米为佳的经分级微珠作为隔离片，这些微珠在诸如丙烯酸类胶粘剂或紫外光激活胶粘剂中制成浆状物，或者利用低熔点玻璃与板粘合。将浆状物印刷在两块板或其中的一块板的表面上形成所需形状的隔离片，然后光固化或热固化。如果需要，还可以使用胶粘剂或含有固体颗粒的低熔点玻璃在凝胶内形成泳道。

也可以将大量的微珠置于凝胶室内的两板表面上来形成两板间的间隔。此时，可利用胶粘剂或具有适当厚度的涂有胶粘剂的塑料薄膜来密封边缘。颗粒也可以同时包含在胶粘剂中和凝胶室内。

附图说明

图1显示本发明微凝胶第一种实施方式的分解图；

图2显示本发明微凝胶的第二种实施方式；

图3显示本发明的第三种实施方式；

图4A和4B显示本发明的另外一种实施方式；

图5A和5B显示用于实施本发明的一种凝胶形成插片；

图6显示本发明的一种加样插片；

图7A和7B显示本发明其它加样和凝胶形成插片的实例；

图8显示本发明的一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置；

图9显示本发明的一种用于分析寡聚核苷酸混合物的装置；

图10显示使用本发明对30单体或31单体的混合物的分析结果；

图11A至11F显示M13 DNA模板的ddT测序反应的分析结果。

本发明的详细说明

图1显示了本发明微凝胶的第一种实施方式的分解图。如图所示，利用底板1，盖板2和夹在两板之间的隔离片3形成微凝胶。隔离片3和1，2两板的内表面界定了凝胶室4。盖板2上有槽口5用于在凝胶上加样，还有槽口6和7，电极可由此通过而与凝胶接触。

如图1所示的微凝胶可通过如下所述的“挤压充填”来制备。首先，将隔离片3与底板1粘合。然后在凝胶室4区域充以未聚合或部分聚合的凝胶，然后在上面压下盖板2。未聚合的凝胶充满了凝胶室4，过量的凝胶被挤出在板的边缘。然后，凝胶聚合，刮去过量的凝胶。