[发明专利]突变型单加氧酶细胞色素P－450cam

说明书

本发明涉及单加氧酶细胞色素P-450_cam的突变体以及用该突变体氧化某些有机化合物的方法。

单加氧酶催化非功能基化的碳水化合物用氧的氧化¹，因此在有机合成上具有重要潜在应用价值。然而，由于在分离足够量的酶和相关的电子传递蛋白上的困难，这方面的发展受到阻碍。尽管可得到多于150种不同细胞色素P-450单加氧酶的氨基酸序列，但至今仅有三种的结构资料是可获得的^2，3，4，并且很少在细菌系统内被成功地超量表达⁵。

一种可溶并能以足够数量地被表达的细胞色素P-450单加氧酶是来自P.putida的高度专一的P-450_cam，它催化樟脑(1)区域和立体选择性的羟基化成5-外-羟基樟脑⁶。已测定了P-450_cam的高解析晶体结构²，由于认为此细菌酶的作用机制与其哺乳动物相应物的作用机制非常相似，它已被用作框架，哺乳动物酶的模型就基于此框架。

P-450_cam的核苷酸序列和相应的氨基酸序列已被描述⁵。知道酶的活性位点的位置并研究了结构-功能关系^13，14。P-450_cam在101和185和247位¹⁵以及87位¹⁶的突变体已被描述。已描述了96位酪氨酸变成96位苯丙氨酸的突变体^12，17，18。但是在所有这些事例中，文章报道了突变对已知氧化反应的机制的影响。没有教导或建议来说明突变可以对不同底物的氧化提供生物催化剂。

在尝试发现新的生物催化剂中，我们开始了一个计划，其目的在于重新设计P-450_cam的活性位点，以使其能够对不能作为野生型蛋白底物的有机分子进行特定的氧化。我们初始目的是在P-450_cam的活性位点掺入一“芳香性口袋”，它会增加含有芳香侧链的底物的结合。

另外，鉴定了(半胱氨酸-334)远离活性位点的表面残基对蛋白处理和稳定性的影响。此半胱氨酸对蛋白纯化时不期望的二聚化负有责任，因此为了改善这两方面的性质用丙氨酸取代了半胱氨酸。

如图1.所示，P-450_cam的三维结构显示活性位点提供与樟脑的疏水性基团近范德华作用。三个芳香残基(Y96，F87和F98)组合一起并排成底物结合口袋，在96位酪氨酸和樟脑酰基氧之间有一个氢键保持底物处于正确的方向以保证反应的区域和立体选择性。用较小的疏水性非芳香性侧链取代这些芳香性残基中任一个能提供期望的“芳香性口袋”。

用分子模型研究点突变对三个芳香性残基的可能影响。用程序GRID⁷计算芳香性探针和细胞色素P-450_cam可能的突变体之间的相互作用的能量，其中突变体的这些残基变成了丙氨酸(F87A，Y96A和F98A)。然后用分子模型软件包Quanta⁸检查以图显示的结果。

突变体F98A在对芳香性探针可进入的活性位点空穴似乎具有最强的结合相互作用，Y96A的结合相互作用少弱，F87A基本上很少。首先确定96位酪氨酸突变为丙氨酸，因为它更接近结合口袋中心，而98位苯丙氨酸在一侧的沟中。而且，由于丢失了结合于底物的氢键，除去96位酪氨酸会降低酶对樟脑的特异性。

根据本发明的一个方面，提供了单加氧酶细胞色素P-450_cam的突变体，其中在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被除苯丙氨酸之外的任意氨基酸残基取代。

根据本发明的另一个方面，提供了单加氧酶细胞色素P-450_cam的突变体，其中在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代，该突变体具有催化以下任一个物质氧化的性质：聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括它们的卤代变体的二苯基和联苯基化合物和卤代碳水化合物。

仍根据本发明的另一个方面，提供了一种氧化选自聚环芳香碳水化合物，线性或支链烷烃，包括其卤代变体的二苯基和联苯基化合物或卤代碳水化合物的方法，该方法包括在氧化条件下把选择的化合物之一与单加氧酶细胞色素P-450_cam接触，其中单加氧酶细胞色素P-450_cam在96位的酪氨酸残基和/或在334位的半胱氨酸残基被其它氨基酸残基取代。