[发明专利]含有水溶性聚合物的BDNF与NT－3的结合物

说明书

发明领域：

本发明涉及一类新的BDNF与NT-3的衍生物以及制备上述衍生物的方法，其中一种BDNF或NT-3的分子被连接到一种水溶性聚合物上。

发明背景：

由于重组DNA技术发展的结果，目前作为治疗用的蛋白质能够以合适的形式足够大量地得到。上述蛋白质的化学衍生物可能会有效地阻止蛋白酶与该蛋白质骨架自身发生接触，从而防止降解。附加的优点可能包括在某种情况下提高该治疗蛋白质的稳定性和循环时间以及降低免疫原性。但应当指出的是一种具体蛋白质的改性效果是无法预测的。有一篇描述蛋白质改性以及融合蛋白的综述性文章，该文章发表在由英国伦敦Mediscript，Mountview Court，Friem Barnet Lane出版的Focuson Growth Factors 3：4-10(1992)上，作者为弗兰西斯。

聚乙二醇(“PEG”或“peg”)为一种如上所述的已经用于治疗蛋白质产物(“聚乙二醇化的蛋白质”)的制备(“聚乙二醇化作用”)的化学部分(moiety)。例如，一种聚乙二醇化的腺苷脱氨酶Adagen^现已获准用于治疗严重的组合免疫缺陷性疾病；聚乙二醇化的超氧物歧化酶已经用于治疗头部创伤的临床试验；聚乙二醇化的α干扰素已经用于治疗肝炎的I期临床试验的测试；聚乙二醇化的葡糖脑苷脂酶以及聚乙二醇化的血红蛋白现已报道正处于预临床试验。对于一些蛋白质而言，已经表明聚乙二醇的连接可以防止蛋白水解〔参见Sada等人，发酵生物工程杂志，71卷，137-139页(1991)〕。对于某些聚乙二醇部分的连接方法而言，人们是可以得到的。上述方法可参见美国专利US4,179,337(Davies等人)以及美国专利US 4,002,531(Royer)。而对于综述性文章可以参见Abuchowski等人。

其它水溶性聚合物也用于使蛋白质改性，诸如乙二醇/丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三氧杂环己烷，乙烯/马来酐共聚物，以及聚氨基酸(或者为均聚物，或者为随机共聚物)。

对于聚乙二醇而言，已经使用多种方法将聚乙二醇分子连接到蛋白质上。一般说来，聚乙二醇分子是通过在该蛋白质中发现的一个活性基团连接到蛋白质上的。氨基(诸如那些在赖氨酸残基或N-末端处的氨基)对于这种连接是非常便利的。例如，上述Royer的专利指出采用还原性烷基化作用将聚乙二醇连接到一种酶上。公布于1993年4月28日的欧洲专利申请0539167指出采用PEG的imidate衍生物或同类的水溶性有机聚合物对带有自由氨基的肽以及有机化合物进行改性。美国专利US 4,904,584(Shaw)涉及通过活性氨基将聚乙二醇分子连接，从而对蛋白质的赖氨酸残基进行改性。

一种具体的已经经过化学改性的治疗蛋白质为粒细胞集落刺激因子，例如G-CSF〔参见欧洲专利公开文本EP0401384，EP0473268以及EP0335423〕。另外一个例子为在美国专利US 5,264,209(Mikayama等人)中所描述的聚乙二醇化的IL-6。公布于1985年9月11日的欧洲专利申请0154316也报道了将淋巴细胞因子与一种聚乙二醇的醛反应。

蛋白质分子的聚乙二醇化作用通常会生成一种经化学改性的蛋白质分子的混合物。举例说明，将含有五个赖氨酸残基以及一个位于N-末端的自由氨基的蛋白质分子按上述方法反应时，可能会生成一种多相混合物，其中一些有六个聚乙二醇部分，一些有五个，一些有四个，一些有三个，一些有两个，一些有一个，一些则一个聚乙二醇部分也没有。在含有若干个聚乙二醇部分的蛋白质分子中，该聚乙二醇部分可能不会在不同分子中连接在相同的位置上。一般说来，上述方法在蛋白质与聚乙二醇分子间需要一个连接部分。由Delgado等人所描述的方法〔参见“通过Tresyl氯化物的活化作用偶联PEG至蛋白质，及其在免疫亲合细胞分配中的应用”，《使用液相体系分离，在细胞生物学与生物技术中的应用》，Plenum出版社，纽约，纽约州(1989)，211-213页〕提及使用tresyl氯化物使得在聚乙二醇与蛋白质部分之间没有连接基团。由于tresyl氯化物的使用可能会产生毒性副产物，所以这一方法可能很难用于生产治疗产品中。