[发明专利]用于DNA测序和DNA鉴定的方法和装置

说明书

发明领域

本发明总体上涉及用于核酸分析的方法和装置，尤其是用于DNA测序的方法和装置。

背景

测定DNA样品中四种核苷酸序列的速度是分子生物学、医学、和生物技术进一步发展的一个主要的技术障碍。从1978就开始使用了凝胶分离DNA分子而进行DNA测序的方法。唯一可行的其它核酸测序方法是杂交测序(SBH)。

基于列阵的SBH方法对DNA分子进行分离、降解、合成或成像时，不要求单个碱基的分辨力。其最为普遍的改进方法，利用长度为K个碱基的短寡核苷酸进行错配辨别杂交，构成的K聚体寡核苷酸组成物的排列可因靶DNA而确定，序列可通过独特的重叠批量寡核苷酸而读出。

在SBH法序列的读出中，在分析的DNA片段中由于随机或生物学原因重复出现的K-1寡核苷酸可加以特殊考虑。如果没有其它的信息，相对小的DNA片段可被完全读出，如每一个碱基对(bp)被读多次。相对长的片段的读出中，不确定性可因K-1寡核苷酸重复出现而增加。如果测定的是突变的或类似的序列则该问题就不存在了。一个序列的已知信息可用以作为模板来组装一个类似的序列。

有几种利用杂交来测序的方法，在SBH格式1中，DNA样品被排成矩阵，标记的探针与样品杂交，带有相同一组样品DNA重复的膜可用以几种探针和/或多重探针的平行杂交。尼龙膜上DNA样品的矩阵杂交经过显影。每一矩阵可以重新利用多次。格式1对于批量进行大量样品测试非常高效。

在SBH格式2中，探针被排成矩阵，一个被标记的DNA样品片段与列阵的探针杂交。在这种情况下，一个片段的完全序列可以通过同时和列阵的探针进行的杂交反应而确定。在测定其他DNA片段的序列时，相同的列阵的寡核苷酸可以重复使用。可通过格式2的印迹或原位杂交的方法而产生矩阵，DNA锚排成矩阵并连接以确定合成寡序列，已证明有特异杂交。在一种格式2的改进方法中，DNA锚排成矩阵并连接而确定了靶DNA末端的寡序列。

在SBH格式3中，使用了两套探针，一套用于排成矩阵，另一套标记后存于多孔板中。在此情形中，靶DNA不需标记。靶DNA和一标记的探针加入到那套列阵的探针中。如果一个附带的探针和一个标记的探针与靶DNA上相邻位置杂交，那么它们可共价相连产生一个两倍长度的序列。这个方法可用于对长DNA片段的测序，如完整细菌基因组，而无需亚克隆成小片段。

本发明中，SBH用于在短时间内有效地鉴定和测序一个或多个DNA样品。该方法已应用于DNA诊断、法医学和基因作图。它也可以用于鉴定引起遗传紊乱和其他性状的突变，用于分析生物多样性以及获得其它许多类型基于DNA序列的数据。

发明概述

如上所述，格式1的SBH利于同时分析大量的样品，对一个样品可在大矩阵上进行上千种样品的平行分析，或者利用小片膜的上千个独立杂交反应分析一些少量样品。DNA的鉴定可能涉及1-20个探针，而突变的鉴定可能在某些情况下要涉及1000多个为每一样品特别选择或设计的探针。为了确定突变DNA片段的特性，要针对在第一轮杂交时检测的每一突变合成或选择特异的探针。

按照本发明，DNA样品可以备成小矩阵，其可以用合适的间隔分开，并可以同时用选自保存于多孔板中的寡核苷酸中的一套探针检测。该小矩阵可包括一个或多个样品，每一小矩阵中的DNA样品可以由突变体或一个序列的各个样品组成。形成较大矩阵的连续小矩阵可为相同矩阵的重复也可为不同的DNA片段。一套通用探针含有能以预定精度分析任何DNA片段的足够量的探针，比如要考虑其冗余量可读出每一bp。这套通用探针可以包括多于对一个特异片段所必需的、但对几千种不同序列的DNA样品的测试还不够的探针量。

DNA或等位基因的鉴定和诊断测序方法包括的步骤为：

1)从一套所提供的代表性的或通用的探针中选出一个子集用于与多个小矩阵中的每一个杂交；

2)加入第一个探针到需平行分析的各个矩阵的每一个亚矩阵；

3)进行杂交并分析结果；

4)去除前面已用的探针并重复将要使用的探针；

5)处理已有的结果得出最终的分析或决定用另外的探针再杂交；

6)对某些亚矩阵进行另外的杂交；并

7)通过全套的数据计算得到最终的分析