[发明专利]骨髓基质细胞的扩展

说明书

发明背景

本发明涉及培养骨髓基质细胞。

骨髓是由造血细胞，骨髓基质细胞和胞外基质组成的复杂的，动态的器官系统。骨髓内的多能干细胞增殖并分化成包括红细胞和白细胞的多种细胞类型。一段时间以来，已知干细胞和基质细胞之间的关系对于此过程而言是至关重要的。对细胞培养的研究已表明：在造血干细胞能生长和分化之前必需确立贴壁的基质细胞层。

骨髓基质细胞是由其形态学和功能确定的细胞不均一的群体。在细胞培养中，它们具有特征性的纺锤形形态，并分泌生长因子和形成胞外基质的成分。在响应于表皮生长因子(EGF；Kimura等人，1988,Br.J.Hematol,69:9-12)，血小板衍生的生长因子(PDGF；Kimura等人，文献同上)，和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Kimura等人，文献同上；Oliver等人，1990，生长因子，3:231-236)的培养中，基质细胞显示出分裂。

成纤维细胞生长因子的发现基于多年前的观察结果，即脑的提取物可以刺激成纤维细胞的分裂(见Thomas,1987，美国联邦实验生物学(学会)联合会杂志(FASEBJ.),1:434-440)。从此分离出特殊的FGF，目前此家族至少含有7个成员，包括酸性和碱性FGF(aFGF和bFGF)。这两种因子由不同的单拷贝基因编码，在氨基酸水平上仅有55％相同(Thomas，文献同上)。

正如大多数生长因子，FGF通过与细胞表面受体结合而发挥它们的促分裂活性。最近已鉴定出4个相关的FGF受体(FGFR1-FGFR4)，每种FGF受体以多种形式存在，对于每种受体形式而言，aFGF和bFGF的相对亲合力有所不同(参见Burgess等人，1989，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem),58:575-606；Dionne等人，1991，美国国家科学院院刊(Ann.N.Y.Acad.Sci),638:161-166；Johnson等人，1993，癌症研究进展(Adv.CancerRes.),60:1-41)。碱性和酸性FGF对肝素的反应也有所不同，在细胞培养中，肝素与两种FGF都络合，但实际上只增加aFGF的促分裂活性(Thomas，文献同上)。

对于涉及造血细胞的很多疾病而言，骨髓移植或植入是有希望的疗法。移植可用于取代被内在的疾病，如贫血症破坏的细胞，或者在造血细胞被化学疗法或放射性疗法破坏的情况下。移植可以是自身移植，即病人可作为他或她自己的供体。或者，病人可接受组织相容性供体的骨髓。然而，迄今为止，培养能被移植和用于多种基因疗法的骨髓，尤其是骨髓基质细胞的条件仍未最优化。基于基质细胞修饰的基因疗法的主要障碍是获得治疗上有用数目的基质细胞。因此，尽管可成功地移植骨髓，但需要成功地移植骨髓基质细胞的基因疗法仍无法实现。

发明概述

本发明是培养骨髓基质细胞的新方法，本发明基于以下的发现，即酸性FGF(aFGF)，或aFGF和肝素的联合能显著增强骨髓基质细胞的确立和随后的扩展。通过利用此方法，在培养中骨髓基质细胞可被扩展成前所未有的水平，这对于治疗用途显然是有利的。因此，此培养方法使得骨髓基质细胞可用于多种类型的基因疗法。

一般情况下，本发明的特征在于扩展骨髓基质细胞以得到总数至少为10⁷，优选为10⁹以上的骨髓基质细胞的方法。此方法包括步骤：(a)例如从骨髓抽吸液中得到骨髓基质细胞；(b)将基质细胞导入其内壁已被明胶(gelatin)，如1.0％的明胶(gelatin)水溶液预包被的容器中，该容器中含有包括酸性成纤维细胞生长因子(“aFGF”)多肽的培养基；和(c)在足以得到增加数目的骨髓基质细胞的条件和时间下，在培养基中扩展基质细胞。在此方法中，培养基进一步优选地包括至少0.05单位/ml的肝素多肽。在导入骨髓基质细胞之前，容器内壁还可被胎牛血清预包被。

具体地说，培养基中可包括1.0-50.0％(体积百分比)的胎牛血清，0.01-100.0ng/ml的aFGF多肽，和0.05-100单位/ml的肝素多肽。在具体的实施方案中，培养基中包括16.0％(体积百分比)的胎牛血清，1.0ng/ml的aFGF多肽，和5.0单位/ml的肝素多肽。