[发明专利]自主复制及肝癌特异表达的肝导向基因转移系统及应用

说明书

本发明涉及自主复制及肝癌特异表达的肝导向基因转移系统及应用，特别涉及将自主复制的肝癌细胞特异表达的质粒载体与人工制备的肝导向核蛋白形成的核酸蛋白复合物，以非病毒感染的方法，通过常规给药(如静脉注射)途径体内定向传递外源基因到肝组织并仅在原发性肝癌细胞才发生表达的一种可应用与原发性肝癌基因治疗的新型基因转移系统。

自基因治疗研究的兴起，肝脏是最引人注目的靶器官之一，这不仅在于将正常功能基因导入肝细胞表达可纠正许多与肝功能相关的遗传缺陷如家族性高脂血症等，同时将治疗性基因或细胞毒性基因导入可望治疗获得性疾病如病毒性肝炎或选择性杀死肝癌细胞。因此以肝组织为对象的基因转移策略正在研究发展之中，总的说来，主要是以下三类：(Ledlye，DHepatic Gene thrapy：present and future，Hepatology，1993，18：1263—1273)

1、间接体内(ex vivo)转移策略，也就是通过手术进行部分肝组织切除术获得原代肝细胞，然后体外培养，以重组逆转录病毒转导，体外选择获得转化细胞再返输种植回体内。

2、直接体内(in vivo)活病毒感染策略，通过肝门静脉注射感染性重组病毒颗粒，通过病毒对细胞的感染的方式将外源基因导入肝细胞表达。

3、直接体内在体(in vivo)受体介导的基因转移策略，在外周静脉注射肝导向性DNA复合物，通过肝细胞特异受体如半乳糖末端糖蛋白受体介导的内吞途径将经血循环流至肝脏的复合物摄入胞内从而实现外源基因定向传递到肝细胞表达。

在这三种基因转移策略中，ex vivo的方式需外科手术及体外组织培养，技术要求高，操作复杂，应用起来受很大限制，而in vivo的方式相对简便直接，是当今研究的热点。采用肝门静脉注射重组活病毒体内感染肝细胞的方法，逆转录病毒载体可以将外源基因整合到宿主染色体而达到稳定表达，但在安全性尚未最后确定且逆转录病毒只能感染有丝分裂细胞的特性实之在肝细胞基因治疗的应用受限制，与逆转录病毒相比腺病毒的感染不需靶细胞的繁殖，可感染静止期的肝细胞，导入的载体DNA不与细胞染色体发生整合，可在一定的时间内维持外源基因的表达，尽管重组腺病毒在小动物及灵长类的试验已为Recombinant DNA Advisory Committee所接受，腺病毒的抗原性仍是尚待解决的问题，重复给药几乎不可能。

肝导向DNA复合物的定向转移是利用肝细胞特异的半乳糖末端糖蛋白受体介导的内吞作用，受体的结合配基(典型为脱唾液酸血清类粘蛋白)共价偶连于多聚赖氨酸上，使此分子带上高密度的正电荷以和DNA分子的负电荷结合成可溶性的紧密的复合物，当复合物中的半乳糖末端糖蛋白成分为肝细胞受体识别并结合时，整个复合物就被受体介导的内吞而内在化进入肝细胞(Wu，G．Y．et al．，Receptor mediated in vitro genetranformation by a soluble DNA carrier system，1987，J．Biol Chem．，262：4429——4432)，另外同此原理，有将乙肝表面抗原偶连到多聚赖氨酸上，利用嗜肝DNA病毒与肝细胞的特异亲和能力将DNA定向导入肝细胞(WO 9220316)，此策略提供了一种成分明确，安全特异的可如常规给药进行的基因体内肝细胞定向传递方式。但在现有的试验方案中，外源基因是克隆于简单的真核表达质粒，被导入的质粒不发生DNA复制行为，仅维持短暂的瞬时表达，并随细胞分裂被稀释或降解，也没有发展一种外源基因在特异性定向传递到肝细胞的同时实现在肝癌细胞的选择性表达的转移系统，而且肝导向的DNA结合分子的制备繁琐，需涉及到一连串的化学合成反应和多步色谱分离过程。

本发明的目的是提供一种能特异性将外源基因定向传递到肝细胞表达的基因转移系统，被导入的DNA在肝细胞染色体外稳定存在并随细胞分裂周期而自主复制，而且基因的表达只在癌变后重新获得分泌甲胎蛋白的肝癌细胞才被激活。

根据本发明自主复制及肝癌细胞特异表达的肝导向基因转移系统包括：

(1)人工制备的既保留DNA结合活性，又能为肝细胞特异受体识别并内吞的半乳糖基化组蛋白。

(2)既能在大肠杆菌中扩增，又能在人细胞自主复制的带EB病毒质粒型复制必需序列元件的EB表达质粒pBVl01(中国专利申请号：96101408．3)见附图1。