[发明专利]球形固定化细胞/酶粒子的制备方法

说明书

本发明涉及一种固定化生物催化剂的制备方法，更确切地说是一种固定化细胞或酶的制备方法。

采用包埋法制备固定化细胞或酶所用的载体有两类。一类是天然高分子材料，如明胶、琼脂和海藻酸钙等，由于其机械强度一般都较差，难以适用于生物反应器中，尤其是流化床类型生物反应器中长期地连续运转。另一类是合成高分子材料，如聚丙烯酰胺等，主要由于其单体往往对菌体或酶有毒性，或者在制备过程中条件相对苛刻，易于损伤酶的活性，且一般亦难以制成球形颗粒，以适应流化床生物反应器操作。近几年来，不少专利文献报导了用聚乙烯醇(PVA)作为载体，在将聚乙烯醇水溶胶凝胶化，改进成形技术使之成为球形，提高凝胶化粒子机械强度，缓和微生物细胞包埋时载体凝胶化工艺条件以及减少酶活力损失方面已取得显著成果。如日本特许昭61-100193A采用硼酸成形方法使聚乙烯醇水溶胶凝胶化，制得了球形的固定化细胞或酶粒子，且机械强度好。但是该过程使用了对细胞或酶具有毒性的硼酸，势必将损伤细胞或酶的活性，因此不适宜PH呈弱酸性范围的微生物细胞或酶的固定化。最近中国专利文献CN1076488报导对该硼酸法进行了改进，采用了硼酸-磷酸的二阶段成形的方法，缩短了细胞或酶与硼酸的接触时间，但还是摆脱不了硼酸，且所用的磷酸盐浓度也较高，约在3～20％。此外，迄今为止所发表的专利文献中都未提及固定化微生物催化剂制备过程中有关孔隙率的调节，使之适应不同大小细胞或酶和不同底物的要求，致使所制备的固定化生物催化剂通透性好，传质阻力小，机械强度高。

本发明的目的在于提供一种球形固定化细胞或酶粒子的制备方法。依此方法制备的固定化细胞或酶，具有规则的球形颗粒，有弹性与韧性，机械强度高，耐磨，其内部有丰富的网状结构，且孔隙率大小可以进行调整，用在生化反应过程中通透性好，传质阻力小，固定化细胞或酶活力高。

为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的。采用无毒聚乙烯醇、海藻酸钙、硅溶胶复合材料，将其制成混合水溶胶，并按比例加入微生物细胞或酶，均匀混合后在成形剂中初步形成规则的球形凝胶粒子，凝胶粒子再经2次的先冷冻后解冻、部分风干过程后，再置于低浓度的致孔剂中，放置一定时间后便可得到所需的固定化细胞或酶粒子。上述制备过程中其特征在于：1.使用的无毒聚乙烯醇复合载体，它是由聚乙烯醇、海藻酸钙及硅溶胶所制成的复合物凝胶，它们在水溶胶中的重量百分数为：聚乙烯醇6～15％，海藻酸钙为0.5～1.5％，硅溶胶为0.3～5.0％；2.所使用的成形剂为CaCl₂水溶液，其浓度为0.1～0.5M；3.所使用的致孔剂是重量浓度为0.03～0.55％的磷酸，或者是重量浓度为0.03～0.55％的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的四种水溶液中的一种。

本发明的具体实施过程是：首先将聚乙烯醇、海藻酸钙和硅溶胶按照上述比例制成混合水溶胶后，高压灭菌消毒。然后加入微生物细胞湿菌体，其含量一般为1～10％(重量)，充分混匀，再将含有该微生物细胞的混合水溶胶在CaCl₂溶液中初步制成规则的球形颗粒。制粒方式可以采用离心式制粒或多喷嘴压力式制粒，实验室可采用蠕动泵滴加制粒。CaCl₂水溶液浓度一般为0.1～0.5M。初具球形颗粒的固定化细胞粒子在CaCl₂水溶液中需保持2～6小时，随后将这些球形粒子置于-10～-30℃下冷冻10～12小时，然后在室温下解冻风干，脱除部分水份，如此冷冻、解冻和部分风干两次以上，再用生理盐水洗涤后，浸于含有0.03～0.55％(重量)的磷酸或磷酸盐(如磷酸氢二钠)的缓冲溶液中，使之进一步形成所需要的具有一定孔隙率的固定化细胞粒子。

纵观固定化细胞粒子的形成过程，影响其粒子大小的主要因素在于混合水溶胶的组成和粘度，以及喷嘴的大小和溶胶在喷嘴处的喷出速度。而影响粒子的孔径和孔隙率的因素在于，聚乙烯醇、海藻酸钙及硅溶胶在水溶胶中的含量，培养基或缓冲液中磷酸根离子的浓度和凝胶粒子在该培养基或缓冲液中停留时间，还有凝胶的风干脱水程度等。这些因素也直接影响到固定化细胞粒子的强度。

以本发明所制得的固定化细胞或酶粒子，外观呈规则的球形颗粒，其粒径一般1.5～3.0mm，有弹性、机械强度好、耐磨损、抗挤压，其内部具有丰富网状结构，有利于细胞的附着与生长，在进行生化反应时，通透性好，传质阻力小。在厌氧发酵过程中产生的CO₂极易排出。用于连续的流化床或固定床反应器中，固定化细胞粒子无漂浮现象，保证了反应器正常运转，并且在使用中具有酶活高和寿命长的特点。