[发明专利]检测沙门氏菌属的寡核苷酸

说明书

沙门氏菌属包含2个种：Samonella enteria(根据生化特征和在DNA水平上的同源性将该种分成6个亚种)和Salmonellabongori。根据菌体和鞭毛抗原的限定将该属进一步分成超过2000个血清型。沙门氏菌属的细菌通常是动物和人的病原体。因此已知在发达国家中沙门氏菌属是最普遍的食物中毒病例的引发者之一；这就是为什么快速和可信的检测沙门氏菌属亚种的方法显得重要的原因。

引起食物毒性感染的沙门氏菌主要属于S.enterica的亚种I(也称I组)。

然而毒性感染不是由沙门氏菌属感染引起的唯一病状。

例如，Salmonella enterica亚种的肠血清型伤寒(下文称为伤寒)是人伤寒发烧的病原体。

如果提供了由沙门氏菌引起的感染的特征且特别需要确定在取自病人或食物的生物学样品中沙门氏菌的存在，那么得到快速和灵敏地检测它们在样品中存在的有效方法似乎是必须的。

到目前为止广泛地用于检测沙门氏菌的标准培养方法需要大量的时间并且不适于诸如食品污染的监测。为了克服这些方法的缺陷，根据分子生物学技术(如杂交试验和以聚合酶链式反应为基础的试验)已提出了一些方法。各种DNA探针已用于几个杂交和PCR方法中以检测食物中沙门氏菌属的亚种。然而，这些技术无一能令人完全满意，因为所用的序列不是完全已知的或不是唯一存在于沙门氏菌属中，因此可能会导致在探针和其它肠细菌DNA序列之间的交叉反应或可能导致大量假阴性或假阳性。

本发明人找到了检测种S.enterica和/或S.bongori所有沙门氏菌的特异而灵敏的方法。最后，他们把注意力集中到Salmonellaenterica亚种的肠血清型伤寒菌株(S.Typhi)和与S.Typhi侵入细胞有关的基因上。

另外，他们限定了能够特异性检测沙门氏菌限定组(例如I组细菌)的某些条件。

本领域的现有技术已表明伤寒菌株能附着到HeLa细胞单层上并能进入这些细胞(Yabuuchi et al，1986)。然而，直到现在，与附着和进入细胞过程有关的遗传决定因素尚未被清楚地鉴定。Elsinghorst等(1989)克隆了伤寒染色体片段，该片段使大肠杆菌型细菌获得穿透Henle 407细胞的能力。最近与伤寒Ty2菌株侵入HeLa细胞有关的另一染色体区域已被鉴定和克隆(Popoff andDion，1990)。

本申请发明人鉴定了一条2.4kb的S.typhiDNA片段，它包含在Popoff和Dion(1990)描述的7.9Kb的Hind III序列之中，该区域能参与Salmonella enterica亚种肠血清型伤寒侵入细胞，特别是HeLa型细胞培养物的活动，而且该区域能用于对种S.enterica和/或S.bongori的所有代表菌株进行一般化诊断或任选地在特定检测条件下对S.enterica I组进行特异性诊断的反应中。

本发明人已鉴定了称为IagA的序列和称为IagB的序列并鉴定为参与细胞侵入，这一特征在由Salmonella enterica亚种肠血清型伤寒菌株引起的感染中表现出来。

这些序列在S.Typhi中的特异性使本发明人提出了其用途，以便规定用于对S.typhi感染的诊断或甚至对沙门氏菌属种S.enterica和/或S.bongori感染的诊断，或在某些情况下检测S.enterica特定组的工具。

可用于对Salmonella entetrica和/或Salmonella bongori感染进行诊断的这些工具包含能用于核苷酸序列扩增反应(例如聚合酶链式反应)中的寡核苷酸。本发明还涉及用于检测S.enterica或S.enterica特异亚种和/或S.bongori之核酸的探针、这些核酸(其中合适的)被扩增的片段。

本发明的主题还涉及用于检测在生物样品(例如食品)或任何用于临床诊断的样品中Salmonella enterica和/或Salmonellabongori存在的试剂盒和方法。根据本发明的特定实例，这些检测试剂盒和方法对S.entericaI组菌株是特异性的。

相反，根据本发明的另一实例，这些方法使搜寻沙门氏菌属S.enterica或S.bongori细菌的存在成为可能。因此，沙门氏菌属包含6个亚种或I，II，III，IV，V或VI组。亚种I，II，III，IV或VI属于S.enterica种，亚种V属于S.bongori种。