[发明专利]中国庚型肝炎病毒C基因序列及其应用

说明书

本发明涉及一种中国庚型肝炎病毒C基因序列及应用。

HCV及HEV的确认及其检测方法的建立澄清了70％以上NANB肝炎的致病因子，但仍有10～20％病毒性肝炎由非甲～戊型肝炎病毒引起。GB是一位感染病毒性肝炎致死的美国外科医生姓名首字母缩略词。虽然在该患者血清中未发现有已知肝炎病毒感染的指标，但其血清接种绒猴实验证明，接种绒猴均有肝炎症状。血清中致病因子可接种绒猴传代，接种10代以上绒猴血清仍可感染志愿者。Simons等首次采用RDA(差异分析技术)法从感染致病因子的绒猴血清中分离出两株类似黄病毒属病毒的新型病毒，分别称为庚型肝炎病毒(A)和(B)[GBV(A)和(B)]。

1.中国药品生物制品检定所，100050  北京

2.北京医科大学微生物系，100083    北京在进一步的研究中，他们还从非甲～戊型肝炎患者血清中克隆出部分GBV(C)基因。相对于GBV(B)，GBV(C)与HCV及GBV(A)有更高的序列的同源性。

本发明目的在于：提供一种中国庚型肝炎病毒C基因序列及应用，从而可以了解中国有无GBV(C)感染，研究中国GBV(C)的基因序列及其特征，建立适当的检测方法及检测系统，探索病毒感染的治疗手段，研制预防用疫苗。

为了解庚型肝炎病毒(GBV)(C)的致病性及中国有无GBV(C)病毒感染，我们采用特异性引物RT-PCR及随机引物扩增相结合的办法从高危人群及非甲～戊型肝炎患者体内分离GBV(C)基因。对RT-PCR产物进行测序结果表明，中国GBV(C)与Simons等报道的序列有较高的同源性，但某些功能区核苷酸差异可达10～40％。基于中国GBV(C)的序列设计引物，可以提高RT-PCR方法的检测率。根据中国GBV(C)推定的氨基酸序列设计多肽及采用中国GBV(C)基因重组表达的抗原，可以提高GBV(C)抗体检测阳性率。利用中国GBV(C)基因，将使我国研制出的疫苗更有效，更安全。

图1为核酸序列测定图谱。

图2为GBV(C)RNA扩增产物电泳图谱。其中图2a：

1，2，7，8栏为阴性对照

3，5栏为扩增阳性产物

4栏为ONA分子量标准PQEM ZF(+)DNA/HAEIII

6栏为DNA分子量标准Φ×174/HaeIII其中图2b：

5，6栏为扩增阳性产物

4栏为DNA分子量标准Φ×174/HaeIII

10栏为DNA分子量标准PGEM ZF(+)DNA/HaeIII

余者为阴性对照

本发明实施方案如下：

(1)非甲～戊型肝炎患者血清：计300例，系来自全国各地并长期保存于-80℃备用；

(2)单采浆站的供血者血浆：计4000例，采自全国各地的单采浆血站；

(3)GBV(C)特异性引物：应用美国最新分子生物学计算机软件色OLIGO 5.0辅助设计。由北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。引物序列为：

外引物：S₁ 5’TCG CCT ATG ACT CAG CAT CC 3’；

        a₁ 5’TCA ACG ACC TCC TCC ACC AC 3’；

内引物：S₂ 5’ATG ACT CAG CAT CCA TCC AT 3’；

        a₂ 5’CTC CAC CAC CAA CCC ACA GT 3’；

(4)随机引物：由军事医学科学研究所合成。序列为：

S：TY GCY ACK GCK ACK CHK G

a：G GAM CHG GKM TGR WAR TGR TAV C

Y＝C Or T；  K＝G or T；  H＝A，C or T；  ＝A or C

R＝A or G；  V＝A or G.

一.GBV(C)RNA的检测(试剂盒化)

(一).GBV(C)RNA的提取

A.方法1