[发明专利]克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法

说明书

本发明涉及微生物领域，特别涉及克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法

鲑鱼降钙素(Samon Calcitonin)SCT是一种由32个氨基酸组成的肽类激素，由鲑鱼后鳃体产生，分子量为3500。到目前为止，已在哺乳动物，鸟类、两栖类、鱼类乃至单细胞生物中都发现有降钙素或降钙素类似物存在。因此许多研究者认为降钙素是一种古老的激素。根据降钙素的一级结构可以分为三类。第一类为偶蹄类动物型：如猪、牛、羊，第二类为灵长类和鼠型如人、鼠，第三类为非哺乳型：如鲑鱼、鳗鱼和鸡的降钙素。三种类型中以第三类即鲑鱼、鳗鱼和鸡的降钙素活性最高，比第一类高10倍以上。鲑鱼降钙素氨基酸序列为：N端→C端：1、半胱氨酸，2、丝氨酸，3、天冬酰胺，4、亮氨酸，5、丝氨酸，6、苏氨酸，7、半胱氨酸，8、缬氨酸，9、亮氨酸，10、甘氨酸，11、赖氨酸，12、亮氨酸，13、丝氨酸，14、谷酰胺，15、谷氨酸，16、亮氨酸，17、组氨酸，18、赖氨酸，19、亮氨酸，20、谷酰胺，21、苏氨酸，22、酪氨酸，23、脯氨酸，24、精氨酸，25、苏氨酸，26、天冬酰胺，27、苏氨酸，28、甘氨酸，29、丝氨酸，30、甘氨酸，31、苏氨酸，32、脯氨酸-NH2。

不同来源降钙素在结构上共同特点为：

(1)降钙素1位和7位半胱氨酸间形成二硫键，使之成为环状结构；(2)在分子中形成一个亲水酯的螺旋；(3)羧基端为脯氨酰胺。其中C端酰胺化对活性影响大，亲水脂螺旋对其活性也十分重要，而1-7位间二硫键对生物活性为非必需的。

降钙素有多种生理功能，主要是调节钙、磷代谢及维持内环境稳定，此外对中枢神经系统的作用已日益引起人们关注。降钙素对骨的作用主要是直接抑制骨吸收，不仅抑制破骨细胞的活性和数量，而且能调节骨细胞的活性而促进骨的生长。因此在临床上主要用于治疗骨质疏松症、高钙血症、Paget’s病，以及癌的骨转移，急性胰腺炎等，降钙素能够抑制肠道对钙离子的吸收，有显著的抑制胃液及胃酸分泌作用，因此在临床上可用于治疗急性消化性溃疡，这一治疗作用正在试用中。此外，由于中枢神经系统中存在有降钙素的特异性受体，因此也可以认为降钙素是一种神经多肽，有较强镇痛效果，因此可以作为镇痛剂使用。

骨质疏松是一种常见病和多发病，据报道欧美发达国家有一亿左右病人，我国达6000万以上，随着人们生活水平提高，寿命不断延长，社会老龄化问题日渐受到重视，防治骨质疏松是其中主要问题之一，目前尽管有多种药物治疗，但50％以上采用降钙素，此外，由于其镇痛效果好，且基本无毒付作用，因此作为镇痛剂也日益受到临床重视。据权威部门估计，到2000年，本药品全球销售额可达十亿美元以上。本品种国内属空白，全靠进口。本发明通过基因工程方法，将鲑鱼降钙素基因克隆至变铅青链霉菌，获得了可以分泌产生鲑鱼降钙素的基因工程菌，如能推向生产，则可以填补国内空白，具有突出社会和经济效益，这是本发明的一个出发点。

当前获得鲑鱼降钙素可以采用下列方法：

1、从鲑鱼后鳃体进行提取分离：

1961年，加拿大Copp等人与渔业公司合作，从500，000条鲑鱼中获得了100公斤后鳃体组织，从中分离提纯获得了鲑鱼降钙素，对其进行了氨基酸组分分析，在此基础上美国Pott’s等确定了其结构。据了解目前日本帝国脏器制药和瑞土Ciba-Geigy公司合作，从鲑鱼进行降钙素分离提取，提取品已基本结束临床实验阶段。由于鲑鱼是较名贵的鱼，产量有限，其后鳃体组织极小，降钙素含量低，因此在实际生产中，提取分离有较大困难。

2、化学合成：

1969年瑞士Guttmann根据天然提取鲑鱼降钙素结构研究的结果，首次成功化学全合成了鲑鱼降钙素，目前临床应用的主要是化学合成的SCT。主要生产厂家有瑞士Sandoz，日本山之内制药及帝国脏器制造公司等。以Sandoz为例1992年销售额已达2．2亿美元。由于固相法合成肽技术难度较大，成本高，因此价格十分昂贵。

3、基因工程方法：