[发明专利]人胸腺素α原及其制备方法

说明书

本发明涉及人胸腺素α原，其cDNA和所述cDNA在细菌，特别是大肠杆菌中的表达。

在T淋巴细胞分化成熟的过程中，胸腺上皮细胞分泌的多种肽类激素可能起着重要作用。Goldstein最先从胸腺素组分中分离到胸腺素α1(thymosinα)，它是一个含有28个氨基酸残基的多肽，其等电点为4.2，分子量为约3KDa。它具有胸腺素组分V的部分功能。人工合成及大肠杆菌表达的胸腺素α1具有相同的生物学活性。

在从胸腺素组分V分离α1时，发现了另一组分，它含有35个氨基酸残基，其N-末端的28个氨基酸序列与胸腺素α1完全一致，具有与α1相同的生物学活性，称之为胸腺素α11。由于胸腺素α1和α11的N-末端完全一致，α11仅在C-末端多7个氨基酸且其C-末端最后一个氨基酸皆为谷氨酸，因此推测可能是体内某一分子较大的蛋白质在蛋白酶作用下分解成α1和α11两种活性成分。

Haritos等在液氮中直接匀浆新鲜大鼠胸腺后，迅速放入煮沸的磷酸盐缓冲液，以灭活内源蛋白酶，蛋白分离时，未出现胸腺素α1和α11，而得到了分子量约为12Kda，等电点为3.55的新组分。序列分析表明，它含有111个氨基酸残基，其N-末端的前28个氨基酸残基为α1序列，前35个则为α11，故称该组分为胸腺素α原(prothymosinα，ProTα)。

人的ProTα基因位于第2号染色体上，由5个外显子和4个内含子组成。与大鼠胸腺素α原不同，人的胸腺素α原为109个氨基酸残基的多肽。分析胸腺素α原cDNA发现，在起始密码子ATG后面紧接着的是胸腺素α原的成熟肽，即α1的序列，cDNA上游及下游也无疏水氨基酸密集的区域，显示胸腺素α原无信号肽。胸腺素α原也无N-糖基化位点。在胸腺素α原氨基酸残基中，酸性的谷氨酸聚集成簇，约占整个氨基酸残基的32％，因它的等电点低。靠近胸腺素α原的C-末端有很多核蛋白共有的Lys-Lys-Gln-Lys片段，所述片段可能为核定位信号，提示胸腺素α原可能作为核蛋白，从而在核内发挥生理作用。Manrow等的工作为此提供了依据，他们将人胸腺素α原基因与β-半乳糖苷酶基因融合，不论β-半乳糖在N端还是C末端，转染真核细胞后，该融合蛋白皆出现于细胞核内，而单独的β-半乳糖苷酶则仅分布于胞浆内，与胸腺素α原融合后方显示该特性。

本发明采用基因工程方法在制备人胸腺素α原方面取得了成功。

因此，本发明的目的之一是提供人胸腺素α原及其制备方法；即通过用植物血球凝集素(PHA)和重组人白细胞介素1(IL-2)联合刺激胎儿胸腺细胞，从中提取总RNA，经反转录PCR获得了人胸腺素α原cDNA；将其克隆到pUC19中，经序列分析表明，与已报道的序列一致。然后将所得的cDNA亚克隆到原核表达载体例如pBV220，pET3α中，转化大肠杆菌，例如，DH5α，从而得到大肠杆菌中以可溶形式表达的胸腺素α原。经活性测定表明，它可明显刺激人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结的形成率。

本发明人发现，在不改变编码胸腺素α原氨基酸序列的前提下，增加胸腺素α原上游引物中的A，T含量，可以明显提高胸腺素α原的表达量，同时，不同培养基对它的表达也有影响。  

因此本发明的另一目的是利用基因工程技术从培养的人胎儿胸腺细胞中获得人胸腺素α原的基因及其在大肠杆菌中的表达。

本发明的目的是提供一种制备人胸腺素α原的方法，包括：

(a)合成富含A，T的引物：

(b)用(a)中合成的引物为模板合成胸腺素α原cDNA；

(c)将(b)得到的cDNA克隆到表达载体中；

(d)用所述的表达载体转化原核细胞；

(e)培养所述的转化原核细胞，将所述细胞破碎后，从上清液中回收所表达的胸腺素α原。

其中所述的胸腺素α原cDNA序列含有图3所示的序列。

其中所述的表达载体选自pBV220，pET32α。

其中所述的原核细胞为大肠杆菌。

其中所述的大肠杆菌选自大肠杆菌DH5α，JM101。

权利要求1方法制备的胸腺素α原。

权利要求6的胸腺素α原在增强动物免疫力方面的应用。

附图说明：

图1表示检测胸腺总RNA的RT-PCR产物。

图2表示重组质粒pUC19的限制酶裂解分析。

图3表示重组胸腺素α原的cDNA序列。

图4表示不同上游引物对胸腺素α原表达的影响，以pBV220DH5α为对照。