[发明专利]一种传感器及其制备方法和利用其进行的测定方法

说明书

本发明涉及一种可精确、快速和容易地测定极少量液体[诸如血液(全血)、血浆、尿液和唾液这些体液]中特定成分(例如乳酸、葡萄糖、胆固醇等)的浓度的传感器，例如乳酸传感器，以及这种传感器的制备方法和测定液体中特定成分的浓度的方法。

日本专利公开文本Kokoku(JP-B)No.58-4557(1983)中公开了一种用于测定施加到试纸上的乳酸的组合物，这种试纸可测定血中的乳酸浓度。在试纸中，载体上具有一个含有乳酸氧化酶(LOD)、过氧化物酶和颜色生成试剂的试剂层。当使用该试纸时，通过测定基于乳酸浓度而改变的反射度来测定乳酸浓度。日本专利公开文本Kokoku(JP-B)No.5-79319(1993)中提供了一种用于试剂层的组合物，该组合物含有乳酸脱氢酶、辅酶I(NADH)、一种电子载体和一种四唑盐。

在这些公开文本的每一个中，都是在血液渗透载体上的展开层，随后被试剂层吸收之后利用光学仪器来检测颜色反应。由于将亲水性多孔材料用于展开层和试剂层，因此即使在单一的测定方法中也需要大量的血液(大约20μl)。而且，当血液量太少时，颜色形成不均匀，从而对测定的准确度产生不利影响或使测定不能进行。

日本专利公开文本Kokai(JP-A)No.6-94672(1994)中公开了一种利用酶电极对乳酸浓度进行定量的方法。在该方法中，使用了一种包括一试剂层的传感器，所述试剂层由在绝缘基底上形成的测定电极和反电极上的亲水聚合物、LOD和一种电子载体组成，并且一隔离层和一覆盖层层叠在试剂层上。由于传感器的电极很小，因此甚至在液体的量很少(例如5μl)时，它也能进行测定。另外，血液可通过毛细作用自动被吸收，从而血液可在电极上均匀扩散。这样，可制止错误测定的出现。

下面将利用一个测定乳酸浓度的例子来说明如上所述用使利用电子载体的酶电极的测定原理：

当利用酶″E″(例如乳酸氧化酶)将底物″S″(要测定其浓度，例如乳酸)氧化成产物″P″(例如丙酮酸)时，酶″E″的活性中的从氧化型″E(ox)″转化成″还原型″E(red)″。还原型酶″E(red)″通过一种用作酶的电子载体的氧化型″M(ox)″化合物又返回到″E(ox)″并且这种电子载体同时被转化成″M(red)″，″M(red)″在工作电极上适当的施加电压下被电解成″M(ox)″。通过测定发生电解时的氧化电流可测定底物浓度。

可参考利用乳酸氧化酶(LOD)进行的乳酸浓度测定，如下表达以上的测定原理：

      乳酸＋LOD(ox)＝＞丙酮酸＋LOD(red)       (1)

      LOD(red)＋M(ox)＝＞LOD(ox)＋M(red)＋H⁺ (2)

      M(red)＝＞M(ox)＋e^-                    (3)

在J.R.Mor和R.Guanaccia，Anal.Biochem.，vol.79，pp319(1977)中描述了这种利用酶电极的测定方法，在此一起作为参考。

当使用这种传感器时，通过使其与传感器入口的样品接触而将液体样品(例如全血、血浆、尿液或唾液)在毛细作用下自动吸收。在进行吸收时，通过排气孔排出空气以使液体样品分配到整个试剂层上。在样品吸收完成之后，试剂层立刻开始溶解并且按照上述的反应式(1)进行酶反应。

将二茂铁、铁氰化钾、萘醌等用作电子载体。通过来自外界电源的应用电路向电极系统施加一个范围在0.3至0.6V的稳定电压而使上述反应式(2)中形成的还原型化合物″M(red)″按照上述的反应式(3)被电解氧化。由于随即得到的电流(e^-)与乳酸浓度直接成正比，因此通过测定电流可得知样品中的乳酸浓度。

上述的传感器几乎直接利用了关于葡萄糖传感器的日本专利公开文本Kokai(JP-A)No.3-54447(1991)中公开的内容，而它具有酶电极方面的问题以及乳酸浓度测定中的其它问题。

首先，亲水性聚合物中含有的杂质与氧化酶之间的相互作用增加了测定中的背景电流。例如，在血液中乳酸浓度大约是葡萄糖浓度的十分之一。于是，当乳酸浓度较小时，如果增加背景电流，会特别影响测定的准确度。

另外，用于乳酸浓度测定的传感器的生产成本也特别是一个问题。即，由于每个单位的LOD的价钱大约是葡萄糖的上百倍，因此为了使一个传感器覆盖较大的测定范围，传感器中得含有大量的LOD，从而导致传感器的成本太高。这样，从生产成本的角度看用于传感器的LOD的量应该减到最小。