[发明专利]荷瑞因子偶联物、其制备方法、含有它的组合物和应用

说明书

本发明涉及荷瑞因子(heregulin,HRG)的偶联物，特别是与表皮生长因子(EGF)的偶联物，涉及这种偶联物的制备方法，含有它们的抗皮肤老化的化妆品或药物组合物，以及它们在化妆品和药物制造中的应用。

老化基本上是一种预先受到控制的细胞过程，但也有紫外线等多种因素强烈加速人上皮细胞的老化。遗传学预定程度和内源外源“磨损”所造成的老化都表现在细胞和分子水平上。防止老化，特别是皮肤老化是人们一直为之努力的目标。现代分子和细胞生物学的研究进展为此提供了必要手段和可能性。

体外研究已证明供体组织的程序老化可由皮肤培养细胞的行为所反映。皮肤成纤细胞应答外源促分裂原的能力逐渐降低(Carlin CR等，Nature,306：617-620,1983)、角质细胞对促分裂原的反应性及形成克隆能力的降低(DanesBS,J.Clin.Invest.50：2000-2003,1971)都与老化相关。与此相似，已证实培养的黑素细胞增殖能力的丧失与老化有关(GichrestBA等，J.Invest Dermatol,83：370-376,1984)。因此，看来理解与老化有关的增殖能力降低所涉及过程的分子机制将最终导致干预老化过程，造成延迟老化或老化细胞的复壮。

最近从人类遗传学和肿瘤学研究中意外地得到了老化过程的、认识，其中研究了细胞增殖的调节机制。生长因子形式的外源信号，如表皮生长因子、荷瑞因子、转化生长因子等引发细胞增殖。因为老化与细胞增殖降低相关，看来老化将影响某些基因表达。发现老年人角质细胞培养中每个细胞产生的表皮细胞衍生的胸腺细胞活化因子(ETAF)和其他因子显著低于新生儿或年青人角质细胞。结合考虑这些研究，提示老化是一种遗传程序过程，它与细胞增殖基因的关闭或负调节(这导致对生长促进信号的细胞敏感性丧失)相关，及与生长因子的产生降低和信号途径中蛋白磷酸化较少相关。

配体与酪氨酸激酶受体的细胞外部分结合诱发受体二聚化，产生的信号跨膜传递，激活细胞内酪氨酸激酶功能区。这导致酪氨酸残基上的自磷酸化，这些残基的功能是作为信号转导分子的锚位点。每个受体酪氨酸激酶似有特征性的信号-转导分子独特组合，一起负责每个因子在靶细胞中的特异而多样的效应。因而分子和细胞生物学的最新发展开拓了老化研究的新领域，现在已知老化过程的基础在于程序化基因调节。

荷瑞因子(HRG)是人类生长因子家族中的一员，它在广泛的人类细胞如上皮细胞或成纤细胞表面上与其受体(ErbB2、ErbB3和ErbB4)相作用，刺激细胞代谢并诱导包括上皮细胞在内的细胞增殖(Carraway Ⅲ,KL等，J.Biol,Chem.269：14303-14306,1994；Carraway Ⅲ,KL等，J.Biol.Chem.270：7111-7116,1995)。但没有荷瑞因子对老年人上皮细胞的活性报导，也没有荷瑞因子在化妆品中应用的报导。

本发明的一个目的是提供一种能刺激上皮细胞生长并使衰老上皮细胞复壮的适于化妆品或药物应用的生物活性化合物。

本发明者经过广泛深入的研究，证明：

1)重组人HRG这一促分裂原大大提高细胞因子如表皮生长因子与衰老上皮细胞的结合；

2)HRG提高细胞因子向衰老上皮细胞中的内在化率；

3)HRG活化衰老细胞的细胞生长基因如S6激酶和MAP激酶，这些基因在年青细胞中活跃并对细胞的增殖和发育起关键作用；

4)HRG大大提高老化人上皮细胞的生长和增殖速度。

从而本发明者首次发现重组人HRG对衰老细胞复壮的强活性。因此HRG能延缓人上皮细胞的老化过程，并能使老化人细胞如上皮细胞复壮。

在试图将HRG用于化妆品的过程中，本发明者发现HRG不能满足化妆品添加剂储存稳定性的要求，在室温下水溶液状态的HRG活性迅速下降，在6个月时残留活性为原始值的约40％，到第10个月时已降至10％以下。

本发明者将HRG与EGF通过偶联剂交联，意外地发现生成的HRG/EGF偶联物不仅保持甚至提高了HRG的刺激上皮细胞生长并使老化上皮细胞复壮的活性，而且显著提高了储存稳定性，从而满足了对化妆品添加剂储存稳定性的要求。

根据以上发现，本发明提供一种下式HRG/EGF偶联物：

HRG-R-EGF

其中R为双官能交联基团。