[发明专利]马莱克氏疾病疫苗

说明书

本发明是关于一种改良的马莱克氏疾病病毒[MDV]疫苗株，以及该病毒的生长方法和包含该病毒的疫苗。

马莱克氏疾病病毒会给家禽工业带来严重的经济损失。大部分严重的经济损失是由血清1型野生型病毒引起的。血清2型和3型也可在该领域中发现。血清1型是一种致癌基因株，血清2型是非致癌基因，血清3型是一种火鸡疱疹病毒(HVT)。不同的类型在它们的抗原特性方面具有高度的相似性，但是临床重要性方面又各不相同。

为了降低由马莱克氏疾病[MD]引起的经济损失，已经研制了疫苗。抗MD的疫苗来自于上述三种血清型。本发明是关于血清1型疫苗病毒。

血清1型MD病毒在体外通常与细胞密切相关。作为这种病毒生长的基质，小鸡胚胎成纤维细胞(CEF)经常被使用。但应用CEF有一些不足之处。CEF是从胚胎化的特异无病原体的鸡蛋中获得。为了获得足够的细胞，需要大量这种昂贵的鸡蛋，而且，收获这些细胞要消耗时间和精力。CEF的质量是变化的，收获的过程要求大量无菌操作，否则很有可能被污染。

在现有技术中，已经描述了几种可以用来生长MDV的细胞型，例如从火鸡、鹅、鸽子野鸡、鹑，以及日本鹌鹑的胚胎中得到的原始成纤维细胞培养物。然而，得到可以产生疫苗病毒的连续细胞系却是非常方便的。

使用连续细胞系获得产品的优点是细胞样品可以很容易地从已经建立并被很好控制的细胞库中获得，细胞库储存在如液氮之中。连续细胞系的质量要比CEF稳定，因为使用连续细胞系费力较少，必须实行的无菌操作较少，被污染的危险也比较低。

令人惊奇的是，现在已经发现MOV血清1型可以在一种连续鸟细胞系中顺利生长。尤其是可以使用鹌鹑细胞系如QT35(日本鹌鹑肿瘤)细胞系。已能适应生长的病毒可以在鸟类细胞系中生长并产生足够高产量的疫苗商品。实验证据表明已适应在例如QT35细胞中繁殖的疫苗病毒还能在小鸡中诱导对抗MD的保护免疫性。这种适应生长的马莱克氏疾病病毒株可源自毒性减弱了的MDV株，例如毒株Rispens，CVI988。

这个发现很令人惊奇，因为从现有技术(cho，1981，Aviandiseases 25：839-846)中已经知道可以用一项实验将血清1型病毒与血清3型病毒区分开，实验中QT35细胞系用作病毒基质。接种血清3型病毒会导致明显的细胞病理学效应(c.p.e.)而接种血清1型病毒后没有检测到c.p.e.，表明这些病毒在QT35细胞中生长不充分。

连续或已建立的细胞系培养物的生长不受条件限制并可无限传代。这与只能维持几代的原始细胞培养物形成对照。原始细胞培养物是细胞的体外培养物，它们是直接从如肝、肾、脾、蛋等组织分离出来的。如果这些供给细胞的组织被微生物污染，那么细胞被污染的可能性也就会很高。甚至对于那些供给细胞或卵的动物的各个方面都进行控制并严格要求其居住条件，也不能保证细胞不带有无关因素。

使用已建立细胞系使建立细胞库成为可能。这是一大批充满alicots的细胞，储存在例如液氮之中。这些细胞都被广泛检测以证实不存在无关因素。因而由于使用这个细胞库而成为产品污染源的风险极其小。而且，与原始细胞培养物相比，已建立细胞系的使用明显地降低了终产品受到污染的危险。

与原始细胞培养物相比，来自细胞库的已建立细胞系的另一优点在于其质量稳定可靠。细胞系的每一个alicot具有相同的质量。与此相对比，以前细胞的质量依靠提供组织的动物或蛋的情况而定。

为了制备适应生长的MDV，用毒株CV1988在QT35细胞中传代。发现病毒在传第一代时增殖程度非常低。在滚瓶(roller bottle)中应用传染的高多重性可以得到一些细胞病理学效应(c.p.e.)。还发现在滚瓶中连续传代许多次之后，病毒产量增加了。相反，在固定培养(鲁氏瓶，每瓶75cm²)传代期间，病毒消失了。图1表示的是MDV的CV1988株以滚瓶或鲁氏瓶两种培养方式在QT35细胞上适应生长的情况，两种瓶中的每一次传代都分别有一个病毒滴度(以每3.10⁷个细胞的¹⁰logTCID₅₀表示)与之相对应。在滚瓶中传代足够多次之后，病毒产量非常高，以至于可获得一个有利可图的生产系统。可以看到，在滚瓶中第12次传代之后，病毒滴度增加了。