[发明专利]含硒抗体酶的制备方法

说明书

本发明属于高活力含硒抗体酶的制备方法

含硒谷胱甘肽过氧化物酶(简称GPX)的催化基团为硒代半胱氨酸(Sec)，它以还原型谷胱甘肽(GSH)为底物，可将过氧化氢(H₂O₂)或脂氢过氧化物(ROOH)还原成水或醇(ROH)，体内缺乏该酶时会引起心脑血管疾病、癌症、克山病、老年性疾病(如白内障)等。目前人们都是用含硒小分子化合物模拟该酶的生物功能，如Ebselen，Glutaselenone等，但催化效率仅为天然GPX的千分之一左右。八十年代后期才出现的抗体酶研究领域为GPX的人工模拟开辟了一条新途径。

目前抗体酶所能催化的反应有近百种，但催化效率要比天然酶普遍低2～3个数量级。中国专利94102481.4公开了题为“化学突变具有底物结合部位的单克隆抗体制备含硒抗体酶的方法”，该方法的制备过程为：GSH与2，4-二硝基氯苯(DNCB)反应，制得S-二硝基苯取代的谷胱甘肽(GSH-S-DNP)作为半抗原；用戊二醛将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联在一起作为全抗原；将全抗原加入福氏佐剂免疫小鼠，用标准单抗制备方法得到对GSH-S-DNP具有特异结合能力的单克隆抗体被命名为4A4。用苯甲基磺酰氟(PMSF)活化单抗可变区丝氨酸残基(Ser)上的羟基，再用硒化氧(H₂Se)处理，则将Ser变成Sec，从而得到具有GPX活力的含硒抗体酶Sec-4A4(为了与没引入催化基团的单抗相区别，将含有Sec的抗体酶名前加Sec)，活力为1239酶活单位/微摩尔(U/μmol)，是天然兔肝GPX(5780U/μmol)的0.21倍，与天然酶相比催化效率还有一定差距，因此如何提高抗体酶活力、使其接近甚至超过天然酶并具有应用价值是抗体酶研究的关键所在。含硒抗体酶Sec-4A4活力不高主要有两个原因：首先是半抗原结构设计的不合理，所用的半抗原为GSH-S-DNP，只是将GSH中较活泼的巯基用2，4-二硝基苯基团(DNP)进行了保护，从而提高了半抗原的稳定性和免疫原性。而用该半抗原免疫得到的单克隆抗体4A4对底物GSH的束缚作用过强，不利于底物向产物的转化；且抗原结合部位的空间相对较窄，不利于脂氨过氧化物进入活性中心，引起催化部位的有效空间窄小，使得催化基团不能充分发挥催化作用。另外天然酶的活性中心是一个位于分子表面扁平低凹处的疏水腔，而该半抗原带有两个负电荷的羧基，因此该半抗原的设计具有一定的片面性。在含硒抗体酶Sec4A4的制备中另一个需要创新的地方就是催化基团的引入。天然GPX中每个活性中心上只有一个Sec，而该发明中引入GPX催化基团Sec的主要步骤为：先用PMSF活化单抗4A4可变区中Ser上的羟基，再通入过量的H₂Se气体，使得Ser变成Sec。其中PMSF和H₂Se都是大过量的，特别是H₂Se不能够定量加入，使得反应体系中有单质硒析出，吸附在抗体分子表面上，很难除去，同时还引起Sec-4A4中Sec的引入过多、过乱，用5，5-二硫基双-2-硝其苯甲酸法测得每分子Sec-4A4上有五个Sec，而一个抗体分子上只有两个活性中心，说明Sec-4A4上不仅活性中心有Sec，而且非活性中心也含有Sec，这些非活性中心的Sec不仅催化效率极低，而且有可能影响活性中心的Sec发挥催化功能，对研究活性中心的催化机理还具有干扰作用，因此引入催化基团的方法还应进一步的改进，这对提高抗体酶的活力也是非常重要的一步。

本发明的目的在于：提出一种新的抗体酶设计理论，设计系列结构合理的半抗原，通过单克隆抗体制备技术得到由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，然后用NaHSe代替H₂Se将催化基团定量引入到疏水腔中，从而得到活力高于天然酶的抗体酶。

本发明是在天然酶结构信息的基础上，以底物为蓝本，用系列疏水性修饰剂修饰底物，屏蔽底物带电基团，包括羧基、氨基、巯基等，增强半抗原的疏水性，从而诱导出在抗原结合部位上具有由底物结合部位和催化部位共同组成疏水腔的单抗，降低抗体对底物过强的亲和力，使得单抗对底物的亲和力与天然酶对底物的亲和力相当，再通过化学修饰方法将催化基团Sec引入，即用PMSF活化单抗可变区中丝氨酸上的羟基，选用液体NaHSe作为亲和试剂与活化的羟基反应，使得每个抗体分子上疏水腔内定量引入一个Sec，其它非活性部位不含有Sec，并且单质硒不易析出。

本发明合成步骤：

Ⅰ．半抗原的设计与合成

选择一组制备具有GPX活性含硒抗体酶的系列半抗原，结构如下：