[发明专利]在大肠杆菌中表达作为分泌的重组人干扰素α1b蛋白

说明书

在大肠杆菌细胞内表达的许多天然分泌蛋白容易降解或形成无生物活性的包涵体。但是，通过采用含分泌载体的宿主，可以将它们分泌到细胞周质中。最近，已经研制了将表达产物传递到上清液中的分泌系统。这些系统优于分泌系统的方面在于1)将蛋白水解减少到最少，和2)更方便地用于检测和纯化样品。

已经大量研究了采用分泌载体在大肠杆菌中表达重组产物的方法。这些方法包括利用(1)“易漏的”突变菌株(Gikes et al.，Bio/Technol.，Vol.2，pp259-263.1984)；(2)与目的产物共表达的溶解蛋白质(Kobayashi etal.，J.Bacteriol.，Vol.166，pp728-732，1986)；(3)天然分泌的蛋白质或大肠杆菌的外膜组分与目的产物融合(Nagahari et al.，EMBO J.，Vol.4，pp3589-3592，1985；Mackman et al.，EMBO J.Vol.6，pp2835-2841，1987)；和(4)强启动子和高效的前导序列以提供有效的表达和分泌(由未知机制导致分泌)目的产物(Pages et al.，J.Bacteriol，Vol.169，pp 1368-1390，1987；Suominen etal.，Gene，Vol.61，pp165-176，1987；Guo et al.，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.49，pp279-283，1988；Wong et al.，美国专利No.5,223,407,1993；Wong et al.，欧洲专利No.EP0357291B1，1996)。在这些方法中，最后一种方式最简单。此外，它使用正常的宿主菌株以便可以得到所需蛋白质的最大表达和最大的细胞生产量。另外，该方法可以利用体内肽酶从信号肽裂解所需产物，由此不需额外的裂解步骤就可从融合蛋白中释放目的产物。

利用上述的最后一种方法，构建称为Tac盒(Wong et al.，1993&1996上文)的合成分泌盒，以在大肠杆菌中分泌生产重组蛋白。所述Tac盒含有在大肠杆菌中高水平表达蛋白质所必需的所有调节元件，包括杂合的tac启动子，用于转录调节的lac操纵子，共有的核糖体结合位点，omp.A前导序列和trp A转录终止子(Wong et al.，1993和1996上文)。为了构建分泌载体，将Tac盒克隆到pUC18中，其中还发现了过表达Lac阻遏物的lac I^q基因和质粒pSC101的分隔元件par(Wong et al.，1993&1996上文)。

除应用Tac盒大肠杆菌分泌系统生产各种异源蛋白质，包括hEGF，hPTH，IL-6和甲状旁腺激素相关的肽外(Wong et al.，1993&1996上文；Rabbani et al.，J.Bone Min.Res.，Vol.6[补充1]，Abstract 133，S116，1991)，存在IPTG诱导的条件下，用Tac盒，表达源于C.fimi(O’Neill et al.，Gene，Vol.44，pp 325-330，1986a)的cex基因的细胞外葡聚糖酶(Exg，使用产色底物，对-硝基苯基-β-D-纤维素二糖苷(pNPC)可以方便地检测表达产物。)，表达产物的分泌生产将导致细胞迅速死亡(图1)，然而，在相同条件下，没有IPTG时，表达Exg的细胞以正常速率生长(图1)。将在Tac盒分泌载体(上述)和cex基因(O’Neill et al.，上文)之间形成的重组构建体称为tacIQpar8cex(图2)。

非诱导的和诱导的JM101(tacIQpar8cex)表达的Exg(Uml^-1)总产率方面有很大的差异(图1和表1)，这可能是由于两种培养物之间活细胞计数的不同(图3)而引起的，但是，两种培养物分泌的Exg活性(Uml^-1)很相似(表1)。结果表明，两种培养物均不能有效生产细胞外Exg。