[发明专利]血小板生成素在原核细胞中的表达及纯化方法

说明书

本发明涉及一种生物工程产品的高效表达方法，更具体地说涉及血小板生成素在原核细胞中以融合蛋白的形式进行表达和纯化。

血小板生成素(TPO)是血液学界寻找已久的具有特异刺激巨核细胞和血小板作用的造血调控因子。1994年由Bartley等克隆(Bartley等Cell 1994；77∶1117)。由于蛋白分子中所含的糖基化程度较多，大多数厂家和实验室采用哺乳动物细胞作为表达体系，代表文献有：Kaushansky等，Nature 1994∶369∶568。美国Amgen公司报道E.coli产物也具有刺激巨核细胞和血小板的生物活性，美国专利：No95/26746。但TPO基因在E.coli中的表达水平较低一直是困扰相关研究者与生产者的难题。另外在哺乳动物细胞中表达血小板生成素其成本高，工艺复杂。

本发明的目的在于提供一种简便高效表达及纯化TPO的方法。具体地说，是提供一种采用融合蛋白的形式，在原核细胞中高效表达重组TPO的方法。为TPO的生产提供了一种快速简便高效的方法。

本发明的目的涉及提供了一种血小板生成素的新的表达和纯化方法，该方法为在原核细胞中以融合蛋白的形式而进行表达及纯化。

根据本发明，用谷胱苷肽硫转移酶(GST)与血小板生成素(TPO)的核甘酸序列融合，在原核细胞中表达，其产物以亲合层析方法进行的。

根据本发明，表达载体采用tac启动子，利用pGEX-1λT载体表达血小板生成素。

根据本发明，纯化层析后采用凝血酶(Thrombin)酶切后生产人TPO。

实施本发明的技术途径主要有：

1.将谷胱甘肽硫转移酶(GST)的cDNA与血小板生成素的cDNA融合，后者位于前者的C末端，其DNA水平酶切位点为EcoRI，其蛋白质水平的酶切位点为凝血酶位点。

2.表达载体为pGEX-1λT，后者的启动子为tac，受体菌为大肠杆菌。

3.产品纯化路线为复性、GST亲和层析、凝血酶切、离子交换。

4.活性测试体系为MO7E细胞系与骨髓巨核系祖细胞(CFu-Meg)，测试方法分别为MTS法与集落生成法。

本发明通过构建GST-TPO融合蛋白表达质粒，在tac启动子作用下实现了TPO在原核细胞中的高效表达，其表达水平达44.56％菌体总蛋白，经GST亲合色谱及凝血酶酶切得到了TPO纯品，为大规模生产TPO提供了一种快速简捷的方法，所得产品可用于治疗血小板低下病人。

结合附图完成的实施例

图一：pGEX-GST/TPO融合蛋白表达质粒的构建路线

图二：含pGEX-GST/TPO大肠杆菌(JM109)诱导表达后菌体蛋白SDS-PAGE

图中1：蛋白质分子量标准

2-4：PGEX-GST/TPO融合蛋白表达菌体

5-7：单独GST表达菌体

2、5：10％扩种1小时后诱导

3、6：10％扩种3小时后诱导

4、7：1％扩种3小时后诱导

图三：融合蛋白经GST亲合色谱柱的色谱

图中A：上样  B：洗脱

图四：融合蛋白纯化结果

图中1标准蛋白分子量  2纯化后融合蛋白

1.mRNA的提取

选择4月龄人胎肝组织为起始材料，利用总RNA提取，mRNA纯化试剂盒(Promega公司)提取mRNA，甲醛变性凝胶电泳表明所提mRNA完整性良好。

2.hTPO cDNA的PCR扩增及序列测定

PCR上游引物为5′CGGAATTCATGAGCCCTGCTCCTCCTG3′，下游引物为5′CCGGAATTCTGATGTCGGCAGTGTCTGAGAACC3′。PCR参数：94℃，1min；50℃，1min；72℃，1min 30Sec，循环数35次。

将PCR产物克隆至pUC18载体。对此克隆以末端终止法进行核苷酸序列测定，结果表明序列完全正确。

3.融合蛋白表达质粒的构建

经EcoRI酶切，碱性磷酸酶去磷酸化的pGEX-1λT载体和用EcoRI酶切的hTPO cDNA，按1∶3mol比连接，以常规CaCl₂法转化感受态Ecoli JM109细胞。挑出转化子于1oml含氨苄青霉素LB培养液培养，提取质粒，经电泳条带大小比较及EcoRI和BamHI酶切鉴定，挑选出含正向插入外源基因的阳性重组子。转化EcoliJM109大肠杆菌。

4.融合蛋白的表达