[发明专利]一种新的人红细胞生成素

说明书

本发明涉及一种人红细胞生成素技术领域，具体地说是一种人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中表达的方法。

红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种重要的造血生长因子，在体内，它可以特异性地刺激骨髓中红细胞前体细胞的增殖、分化，增加成熟的红细胞从骨髓向外周血中的释放量。肾脏是成年人体内红细胞生成素的主要产生部位，因肾衰竭引起的红细胞生成素的产生减少会导致贫血。临床上已经将红细胞生成素用于治疗肾衰竭引起的贫血、AIDS病人因齐多夫定治疗所致贫血以及肿瘤病人因化疗所致的贫血，在手术及骨髓移植中，红细胞生成素也得到较好的应用。经红细胞生成素治疗后，病人体内红细胞压积及血红蛋白水平明显升高，对输血的依赖性明显降低，因此，红细胞生成素的临床应用前景十分广阔。

天然人红细胞生成素主要是从贫血病人的血液或尿中提取，因其来源十分有限，无法满足临床及科研的大量需求。重组DNA技术的发展，为大量生产人红细胞生成素提供了一条新的途径。1985年以来，已有许多学者成功地在哺乳动物细胞中表达了人红细胞生成素(Fu-kuen，Lin等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，82：7580-7584，1985；Kenneth Jacobs等，Nature，313：806-810，1985；Jerry S.Powell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：6465-6469，1986；黄利文等，中国科学B辑，24：178-184，1994)。这些在哺乳动物细胞中表达的基因工程人红细胞生成素具有与天然人红细胞生成素相同的体内、体外活性。目前基因工程人红细胞生成素的基因克隆及其在哺乳动物细胞中的表达主要遵循如下方法。

1.编码人红细胞生成素的DNA片段的获得：主要有两种方式获得编码人红细胞生成素的DNA片段。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后进行体外拼接。另一种是提取人胎肝mRNA，经逆转录合成cDNA文库。或是筛选人胎肝基因组文库，得到编码人红细胞生成素的基因，切下人红细胞生成素基因与表达载体相连接，导入哺乳动物细胞，提取mRNA，再逆转录成cDNA文库。筛选cDNA文库，得到编码人红细胞生成素的DNA片段。

2.编码人红细胞生成素的DNA片段与表达载体相连接。常用的表达载体有pDSVL、pSV2，这两种质粒带有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，也可以用pDll，不含dhfr基因。

3.细胞株的构建：将重组质粒导入哺乳动物细胞，经筛选得到所需要的细胞株。常用的宿主细胞为COS细胞及CHO细胞。

根据已发表的文献，中国人红细胞生成素的基因组成与结构以及红细胞生成素的氨基酸序列与国外发表的文献相同。EPO基因编码区可编码193个氨基酸，其中前27个氨基酸组成前导信号肽，其余166个氨基酸组成成熟蛋白，其分子量为18399D。重组EPO分子因糖基化程度及糖型组成不同，其分子量从26KD到34KD不等。

本发明提供了一种新的人红细胞生成素及其生产方法，该生产方法包括重组DNA载体的构建，将重组载体DNA转染哺乳动物细胞，培养细胞，从上清中纯化得到一种新的人红细胞生成素。

本发明还提供了一种编码人红细胞生成素的新的DNA分子。该DNA分子的第418位碱基为C，已发表的文献为G。

本发明还提供了一种新的人红细胞生成素的氨基酸组成序列。该序列由193个氨基酸组成，其中前27个氨基酸组成信号肽，后166个氨基酸组成成熟蛋白，成熟蛋白的第113位氨基酸为Arg，而不是Gly。经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表观分子量为36～45KD，为一糖蛋白。本发明的人红细胞生成素的衍生物也包括在本发明中。

本发明还提供了一种重组DNA分子。将编码人红细胞生成素的DNA片段与表达载体pCRIII相连接，得到重组质粒pE/C。

本发明还提供了用于表达人红细胞生成素的哺乳动物细胞。将质粒pE/C与pDHFR共转染中国仓鼠卵巢细胞，得到表达重组人红细胞生成素的工程细胞株，其表达量超过10000U/ml·10⁶细胞，为现有细胞株表达量的2～3倍。

本发明还提供了含有一种新的人红细胞生成素及其衍生物的药品，在该药品中本发明的红细胞生成素及其衍生物作为药品的全部或部分活性组份。