[发明专利]酶法生产D－对羟基苯甘氨酸的膜反应方法

说明书

本发明是一种用于固定化细胞生产D-对羟基苯甘氨酸的膜反应方法。

D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)是生产半合成青霉素和半合成头孢菌素的主要侧链，其合成方法有化学拆分和酶法拆分两类。由于化学法存在成本较高，污染严重等问题，因而酶法拆分日益受到重视。酶法拆分的基本原理是利用含有二氢嘧啶酶的微生物细胞定向转化D-对羟基苯海因(D-p-HPH)为D-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-N-Carbamyl-p-HPG)；再利用含有氨甲酰水解酶的微生物细胞将其水解为D-对羟基苯甘氨酸(D-p-HPG)。在反应条件下，L-对羟基苯海因自发消旋为D-对羟基苯海因，达到DL-对羟基苯海因的完全转化。两种酶可分别含在两种微生物细胞内，也可采用同时含有双酶的微生物细胞使两步酶反应进行一次转化DL-对羟基苯海因为D-对羟基苯甘氨酸。目前，酶法拆分的主要问题在于所使用的微生物细胞所含氨甲酰水解酶的活力偏低，半衰期过短。导致中间产物水解时间过长，转化率偏低。由于细胞含酶活力偏低，采用常规细胞固定化技术可增加酶活稳定性，但固定化细胞酶活降得更低而难以使用。从微生物细胞中分离、提取氨甲酰水解酶制成固定化酶的技术已有使用，但酶的成本过高，且产品收率也偏低。

本发明的目的是提供一种制备D-对羟基苯甘氨酸的方法，采用这种技术生产D-对羟基苯甘氨酸，污染少、收率高、生产成本低。

为实现上述目的，本发明将膜反应技术与酶法生产D-对羟基苯甘氨酸技术相结合，实现反应与分离一体化。具体地说本发明的特征是采用中空纤维或平板微滤、超滤膜反应器，固定化含有氨甲酰水解酶或同时含有二氢嘧啶酶的微生物细胞，可提高氨甲酰水解酶的稳定性，转化DL-对羟基苯海因为D-对羟基苯甘氨酸。这种固定化方法可不损失氨甲酰水解酶的活力，并可根据微生物细胞中酶活高低调节固定化细胞在膜反应器内细胞的负载密度，以提供足够的酶活力，催化水解D-N-Carbamyl-p-HPG为D-p-HPG。

采用本发明的膜反应器固定化细胞的技术，在反应过程中采用压滤操作模式，可间歇操作，也可连续操作。所采用的反应条件将根据微生物细胞的催化动力学行为按常规技术进行设计、调节和控制。对于含有双酶的微生物细胞，也可按常规技术将通过膜的渗透通量等反应条件的控制调节使二氢嘧啶酵的表观活力与氨甲酰水解酶的活力相匹配。避免D-N-Carbamyl-p-HPG的积累，实现DL-p-HFH向D-p-HPG的高产率转化。

本发明所用的膜反应器可以是商用的中空纤维或平板型微滤、超滤膜分离器，也可以自行构建加工由各种材料制成的微滤、超滤膜组成的各种形式的膜反应器。反应器中膜的孔径以完全截留微生物细胞为准则。

固定化在膜反应器中的生物催化剂为含有氨甲酰水解酶或同时含有二氢嘧啶酶的各类自然筛选菌株、诱变菌株、基因重组菌株或上述菌株的一部分，也可以是相应的固定化酶。

待固定化的微生物细胞将通过交联剂或絮凝剂处理后送入膜反应器一侧，在压力推动下，液体透过膜排出，细胞因截留而固定在膜反应器内。所用的交联剂可以是戊二醛、双重氮联苯胺-2，2′-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、己二酰亚胺酸二甲酯和多胺，或联用；所用絮凝剂可以是聚丙烯酰胺、聚羧酸、聚乙基胺、聚赖氨酸、氯化钙、氧化钙、磷酸氢钙，或联用。处理时细胞的密度为0.8～5％(湿菌重／V)，交联剂浓度为0.01～12.5％(对温菌重)，处理温度为0～30℃，PH4.0～9.0.絮凝剂的浓度为0.1～10％(对湿菌重)，处理温度为20～40℃，PH5.0～9.0。

本发明的膜反应的操作过程是将溶液储罐中带有未溶颗粒的DL-对羟基苯海因溶液通过滤网以压滤操作模式泵入膜反应器中固定化细胞一边，反应液透过膜后返回溶液贮罐，直至底物转化为产物。反应系统用氮气保护，反应温度30～40℃，P6.5～9.0。

膜反应器操作方式可采用批式操作或连续操作。采用批式操作，可在排出料液后再次投料进行反应。下面通过实例对本发明的技术给予进一步地说明。

实例1．菌体絮凝处理实验