[发明专利]一种分离氨基酸和多肽的介质及其分离方法

说明书

本发明涉及生物化学领域，提供了一种分离氨基酸和多肽介质的制备方法及用于分离氨基酸和多肽的方法。

亲和层析分离由于具有很高的特异性，良好的选择性和极高的纯化倍数，因此该技术发展十分迅速，广泛应用于生物工程对有机分子的纯化分离。与本发明相近的用于蛋白质水解液中氨基酸和多肽的分离技术，如日本专利公开特许公报平3-282367(1991)和Analy tical Biochemistry杂志[97，367-375(1979)]公开了一种改进的在葡聚糖-铜介质上分离氨基酸和多肽的方法。该方法可用于游离氨基酸的定量分析。所用介质是在碱性条件下，使二价铜结合于葡聚糖上制成的。在分离过程中，介质必须以碱性缓冲液平衡后，再以碱性缓冲液洗脱，继之以盐酸洗脱，才能使氨基酸与多肽完全分离。上述方法，处理量小，分离过程复杂。

本发明的目的是制备一种用于分离氨基酸和多肽的固定化金属离子亲和层析介质，并利用该介质对氨基酸酸和多肽进行分离。该亲和层析介质中金属离子结合牢固，不易流失，用于分离氨基酸和多肽的过程简单，处理量大。

本发明的分离氨基酸和多肽的亲和层析介质是采用高交联度葡聚糖凝胶经化学接枝后与二价金属离子如Fe⁺⁺，Cu⁺⁺或Zn⁺⁺进行化学键合制备而成。具体地说是按下步骤：

1.葡聚糖凝胶与环氧氯丙烷在碱性介质(pH12～14)中进行反应得到环氧化葡聚糖凝胶；反应温度为20～40℃，进行5～20小时。2.在上溶液中加缓冲液使pH为10～11，加亚氨基二乙酸(IDA)，得到IDA-葡聚糖凝胶。反应于40～80℃下，进行15～30小时。3.取上述凝胶装柱，通入含Fe⁺⁺，Cu⁺⁺或Zn⁺⁺离子的水溶液进行化学键合，反应在20～30℃下进行。即可得到本发明的亲和层析介质。

上述制备过程中，对于100g葡聚糖凝胶，步聚1中加入20～40ml环氧氯丙烷；步骤2中加入5～20g亚氨基二乙酸；步骤3中可用含金属离子的盐酸盐、硫酸盐或硝酸盐，含金属离子的浓度为20～50mM。此外，步骤1和2中可加入还原剂例如NaBH₄，其加入量为0.1～0.5g。制备过程所用的碱性介质可加入NaOH或KOH。缓冲溶液用Na₂CO₃-NaHCI₃和硼砂-NaOH缓冲液。

利用本发明制备的亲和层析介质可以方便的分离氨基酸和多肽。具体作法是将含氨基酸和多肽的水溶液通过装有上述介质的层析柱。经水洗脱、酸洗脱即可使氨基酸和多肽实现完全分离。该亲和层析介质经水-酸洗脱后还可再生循环使用。

下面通过实例对本发明的技术给予进一步地说明。

实施例1

取经水溶胀后的葡聚糖凝胶Sephadex G10(100g)，加2MNaOH(50ml)、环氧氯丙烷(5.0ml)和NaBH₄(0.20g)，于室温下搅拌反应，并在2小时内逐渐加入2MNaOH(50ml)和环氧氯丙烷(25ml)。搅拌过夜后，加2MNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液(pH＝10.5，100ml)，亚氨基二乙酸(IDA，10g)和NaBH₄(0.12g)，于60℃下搅拌反应24小时后，用水→乙醇→水洗涤，得白色IDA-SephadexG10凝胶。取部分凝胶装柱(高5.0cm，直径2.0cm)后，加20mMCuSO₄水溶液流过凝胶，直至白色凝胶全部转变为天兰色，此即为固定化Cu²⁺亲和层析介质。介质经水充分淋洗平衡后，上氨基酸(L-Val.L-His.L-Tyr和L-Try混合物)与二肽(Tyr-Try肽)混合水溶液样品2ml(～10ml)后，按30ml/h流速，先后以水和0.1MHCl水溶液洗脱。经上述处理，氨基酸与二肽完全分离。

实施例2

将用过30次的实施例1的层析介质，经0.1MHCl→水充分淋洗后，上贻贝的酶水解液2ml后，以30ml/h流速，先后以水和0.1MHCl水溶液洗脱，经上述处理贻贝水解液中的氨基酸和多肽完全分离。洗脱液分别合并，浓缩析出，干燥后，得多肽54mg，复合氨基酸30mg。复合氨基酸为白色带针状结晶粉末，纯度大于96.0％。

比较例1