[发明专利][B9谷氨酸,B10门冬氨酸]人胰岛素

说明书

作为治疗糖尿病的特效药，胰岛素应用于临床已有70多年，是临床上用量最大的蛋白质类药物。胰岛素的生理功能在於保持人正常的血糖水平。通常，饭后30-60分钟内血胰岛素达到高峰，120-180分钟内恢复到基础水平，与进餐后的血糖高峰协调一致。目前临床上使用的含锌胰岛素制剂主要以六体等多聚体形式存在，而胰岛素是以单体形式表现其生理功能。因此，注射到皮下后需逐渐解离成单体，120分钟血中才出现高峰，并且此峰值一直持续到180-240分钟，造成病人一段时间内因血中胰岛素浓度过低而出现高血糖症状，随后又因血胰岛素浓度过高而表现为低血糖(Brange J,et al.,Diabetes Care,1990,13:923)。为了改善这种状况，改进胰岛素性能，以得到能迅速降低血糖水平的单体胰岛素制剂已成为临床治疗的迫切需要(Brange J,et.al.,Nature,1988,333:679；Brange J,et al.,Cur Opin Struct Biol,1991,934)。

胰岛素单体聚合为二体时由B12Val、B24与B25Phe、B16与B26Tyr等组成的疏水面、B链羧端反平行β折叠以及其它一些氢键等参与作用。三个二体依靠极性和非极性作用，以及配位键形成六体。因此，改变参与形成二体的氨基酸残基以阻碍二体的形成，即有可能获得单体胰岛素类似物。

胰岛素的三维结构分析表明，B9Ser位于形成胰岛素二聚体的疏水面内(Baker EN,et al.,Phi Trans Roy Soc London B.,1988,319:369)，基于此，Brange等(Nature,1988,333:679)将B9的Ser改为Asp，以排斥二聚体的形成，获得在药剂浓度下以单体形式存在的胰岛素，成为临床需要的速效胰岛素(Kang S,et al.,Lancet,1990,335:303)，本实验室用Glu取代B9Ser，得到了类似的结果。但它们的生物活力明显降低，约为天然胰岛素的二分之一。此外，本实验室用Asp代替B10His获得高活力[B10Asp]人胰岛素。Burke等(Biochem Biophys Res Comm,1990,173:982)用化学合成方法比较了一系列与B10Asp组合的胰岛素类似物，发现B10His被Asp取代后，能普遍提高相应的胰岛素类似物的生物活力。

基于以上结果，本发明利用蛋白质工程方法制备了单体胰岛素类似物--[B9 X,B10 Y]人胰岛素，其中X、Y均为酸性氨基酸(具体实施为[B9Glu,B10Asp]人胰岛素；含猪胰岛素前体(porcine insulinprecursor,PIP)突变基因的表达型质粒的酵母菌株Saccharomycescerevi siae YS92/pLL[B9E,B10D]PIP(XV-700-6B)(CCTCC NO.M95042)已保藏在中国典型培养物保藏中心(中国·武汉·武汉大学校内)。[B9Glu,B10Asp]人胰岛素的受体结合能力为猪胰岛素的34.4％，体内生物活力则与天然胰岛素基本相同。因此，本发明可望作为单体速效胰岛素应用于临床。

本发明的技术特征在下述的实施例中作具体描述。

本发明的附图作以下说明：

图1．猪胰岛素前体(PIP)基因的突变。

图2．突变胰岛素B链改变区域的DNA序列图谱。

图3．表达产物在Sephadex G-50柱(2.6×160cm)上的层析图谱。

峰3为[B9Glu,B10Asp]PIP。

图4．聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH8.3)图谱。

图4(a).Sephadex G-50纯化之[B9Glu,B10Asp]PIP(A)及进一步经HPLC纯化的[B9Glu,B10Asp]PIP(B)。

图4(b)．B30Thr(Bu^t)-OBu^t[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(A)；[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(B)；对照(C)：上面条带为B30Thr(Bu^t)-OBu^t人胰岛素，靠下条带为猪胰岛素。

图5．胰岛素HPLC图谱。

图5(a)．纯化的[B9Glu,B10Asp]PIP。

图5(b)[B9Glu,B10Asp]人胰岛素。

图6．转肽反应混合物的HPLC图谱。

图7．[B9Glu,B10Asp]人胰岛素(o-o)和猪胰岛素(x-x)与人胎盘细胞膜胰岛素受体的结合曲线。