[发明专利]从葡萄糖发酵制备2－酮基－L－古龙酸的新方法

说明书

本发明涉及生产维生素C的新工艺。具体来说。本发明以葡萄糖作为原料，采用两种微生物进行串联发酵和微生物转化，通过生成中间体2，5-二酮基-D-葡萄糖(盐)(2，5-diketo-D-gluconicacid，简称2，5-DKG)来制备维生素C的重要前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KLG)的新方法。

2-KLG是合成维生素C的一个重要前体，从本世纪三十年代以来，维生素C工业化生产一直采用“莱氏法”(“Reichstein′s Method”)进行化学合成(图1)，需要五步反应过程并消耗大量有毒有害化学物质。我国于七十年代初期发明的“二步发酵法”在工艺上有所改进，但仍需用葡萄糖高压加氢生成的D-山梨醇作为原料(图2)。

本发明的目的在于寻找一种利用葡萄糖直接发酵产生2-KLG的方法，力求简化维生素C生产工艺并开拓新的代谢途径。

本发明的目的是通过诱变选育能直接利用葡萄糖的菌种及进行相应的发酵工艺研究而得到实现的。具体地说，是使用了欧文氏菌属(Erwinia sp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)进行串联发酵，并筛选获得了优良的欧文氏菌SCB125(武汉：武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心。保藏编号：CCTCC～NO：M96010)和棒状杆菌SCB3058(武汉：中国典型培养物保藏中心。保藏编号：CCTCC～NO：M96011)，从欧文氏菌SCB125发酵生产中间体2，5-DKG进而由棒状杆菌SCB3058转化为2-KLG(图3)。

为了使本发明被更好理解，下面对技术方案作较详细的说明：

发酵菌株的生理生化特征：

可以利用葡萄糖生成2，5-DKG的微生物有葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)和欧文氏菌属(Erwinia sp.)菌株。本发明采用的菌株是欧文氏菌属(Erwinia sp.)SCB125。SCB125菌株主要形态及生理特征如下：

细胞短杆状，革兰氏染色阴性(G^-)，无芽孢。28-30℃培养三天后，细胞大小为0.6-0.8×1.2-3.5微米(μm)，单个排列为主，次端生鞭毛(近似周生鞭毛)有粘液物质形成。未见到多形态细胞，但可观察到有丝状结构物形成。菌落圆形，平滑，培养三天以上在菌落表面可出现皱褶。最适pH6.5-8.0，最适生长温度25-35℃，可利用葡萄糖产酸，可利用葡萄糖酸盐和瑚珀酸盐，好氧，氧化酶阴性，接触酶阳性。

能将2，5-DKG转化生成2-KLG的菌株有棒状杆菌属和短杆菌属菌株。本发明中转化2，5-DKG产生2-KLG的菌株是棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058菌株，主要生理特征如下：

细胞呈短杆状，革兰氏染色阳性(G⁺)至可变(G±)，无芽孢。在普通牛肉汁斜面培养基上30℃培养两天后，细胞大小为0.6-0.8×0.9×2.1微米(μm)，单个或成对排列，可观察到明显的栅状交叉排列。菌落圆形，呈黄色，表面光滑微有突起。在含有硝酸盐及铵盐的培养基上生长良好，最适pH7.0-8.0，最适生长温度25-30℃，可利用D-葡萄糖酸及微弱利用2-酮基-葡萄糖酸(2-KDG)。好氧，接触酶阳性。SCB125的诱变筛选

以初筛得到的能转化D-葡萄糖生成2，5-DKG的988作为出发菌株，通过紫外和亚硝基胍先后进行诱变，并在选择性平板上分离得到能产生明显溶钙圈的单菌落，最后以发酵对比试验挑选转化率高且性状稳定的菌株，编号SCB125；选择性培养基的成分为：D-葡萄糖10％，玉米浆2％，KH₂PO₄ 0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，CaCO₃ 3％。串联发酵工艺过程

在含有葡萄糖，碳酸钙，玉米浆，磷酸氢二铵的培养基中以及合适的通气条件下，把欧文氏菌SCB125进行液体培养。当初始葡萄糖被利用至快耗尽时，流加50％葡萄糖液以促使微生物发酵产生2，5-DKG。发酵终了用表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)处理达到灭菌的目的以作为下一步发酵的底物。

在含有葡萄糖，氯化铵和玉米浆的合适培养基中，将棒状杆菌SCB3058进行通气培养。当SCB3058生长到一定时间，开始流加经SDS处理过的2，5-DKG发酵酪液作为反应底物，转化产生终产物2-KLG。同时加入0.2％(w/v)葡萄糖作为氢供体，以使转化反应得以顺利进行。