[发明专利]一种用变色酸衍生物比色测定血清镁的方法

说明书

本发明属于血清镁比色法测定技术领域。

血清镁的测定方法有原子吸收分光光度法、酶偶联速率测定法和比色法等。原子吸收分光光度法是镁测定的参考方法，因仪器条件限制难以普及。酶偶联法国外文献有过报导，国内未见应用。基于金属络合剂显色的比色法操作简便，反应迅速，其中的Calmagite法和甲基百里酚蓝法(MTB)被广泛采用。但上述两种比色法的灵敏度、MTB法的试剂及反应液稳定性不甚理想。

本发明的目的是提供一种使用国内新合成的金属离子络合剂2--(8′-羟基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-变色酸(8Q5SAC)进行血清镁测定的方法。本发明方法简便、微量、快速、准确、稳定，本方法灵敏度、试剂稳定性明显优于Calmagite法和MTB法，适用于血清镁的常规手工分析和生化分析仪分析。

本测定方法的实施

原理8Q5SAC在碱性缓冲介质中与血清镁络合呈色，波长541nm处有一主吸收峰。以乙二醇双(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清钙。反应液吸光度与镁浓度在一定范围内成正比。

材料与方法

一、试剂

1、缓冲液：每升含甘氨酸0.1mol、NaOH 0.13mol、NaCl 0.2mol，EGTA0.2mmol NaN₃15mmol。

2、显色剂：每升含8Q5SAC(南昌大学合成)0.3mmol，聚乙烯吡咯烷酮5g，op乳化剂6ml

3、10mmol/L镁标准液

4、镁标准应用液(1.0mmol/L)

5、应用试剂：试剂1、2等量混合。室温密闭遮光保存，稳定期至少两周。

二、仪器

1、722型分光光度计

2、pH计

三、方法

在测定、标准、空白管中分别加人血清、镁标准应用液(1mmol/L)、水各0.02ml，每管加应用试剂3ml。混匀。静置2分钟。540nm波长，1cm光径，空白管调零比色。

计算：血清镁(mmol/L)＝(测定A/标准A)×1

式中：测定A：测定管吸光度；标准A：标准管吸光度；

1：镁标准应用液浓度1mmol/L

实验结果

一、吸收光谱

以应用试剂调零，镁反应液的吸收光谱(图1)在541nm和575nm处有两个吸收峰，541nm为主峰。

以水调零，应用试剂的吸光度从480nm-600nm为一上升坡形，541nm处空白吸光度明显低于575nm处吸光度。

所以，选择540nm为测试波长。

二、缓冲体系及pH的选择

分别配制以甘氨酸-NaOH和硼酸盐为缓冲体系的系列pH应用试剂与镁反应。以对应管试剂空白调零，读取各管吸光度，图2。其灵敏度甘氨酸-NaOH缓冲体系在pH11.2时最高，硼酸盐缓冲体系在pH9.8时最高，前者的灵敏度大大高于后者。

以pH11.2，终浓度25-75mmol/L的甘氨酸缓冲体系应用试剂测镁，甘氨酸浓度为50mmol/L时灵敏度最佳。

选择应用试剂缓冲体系为甘氨酸-NaOH，pH11.2，甘氨酸终浓度为50mmol/L。

三、8Q5SAC浓度选择

试剂空白吸光度与8Q5SAC浓度成正比，测试灵敏度与8Q5SAC浓度在一定范围内正相关，图3，8Q5SAC浓度达0.15mmol/L以上时，灵敏度不再上升。兼顾空白吸光度和灵敏度，选择应用试剂中8Q5SAC终浓度0.15mmol/L。

四、EGTA浓度选择

8Q5SAC法测定血清镁的最大干扰源是钙。EGTA在pH11.2的反应介质中对钙的选择性明显大于镁。配制含系列EGTA浓度(50-150umol/L)的应用试剂，观察镁灵敏度和钙掩蔽作用。各浓度管的镁灵敏度基本一致，EGTA浓度达75umol/L，可掩蔽样品钙浓度达8mmol/L。

选择EGTA终浓度为100umol/L

五、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化剂浓度选择

聚乙烯吡咯烷酮可防止蛋白质干扰反应，降低空白吸光度，提高测试灵敏度，并改变反应液吸收光谱(吸收峰由523nm、560mm移至541mm和575mm)。经试验聚乙烯吡咯烷酮终浓度为2.5g/L时，反应灵敏度最高。

OP乳化剂可防止蛋白质对反应的干扰，降低空白吸光度，提高反应灵敏度。OP乳化剂终浓度为3ml/L时，灵敏度最高。

六、干扰试验