[发明专利]用内含特殊基因质控模板的试剂识别聚合酶链反应真假阴性的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种PCR检测方法及其试剂盒，特别适用于乙型肝炎、结核等各种病毒性、细菌性疾病的PCR检测。

PCR——聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，或称基因扩增(Gene Amplification)，是目前世界上最先进的检测细菌性和病毒性疾病的一种方法。它具有灵敏度高、特异性强、快速简便、准确可靠的无比优越性。近几年来，各国普遍应用这种方法作为临床检验病毒性肝炎、结核、淋病，及其它多种疾病的权威手段。这一检测方法在我国推广特别迅速，各省各大医院乃至一些中小医院都开展PCR检测，PCR检测试剂的销售及研制一度极旺。

然而，PCR是一项高新技术，用好这项技术必需具备必要的条件并遵守严格的规范，否则，不可能得到准确可靠的检测结果。我国因种种原因而使PCR检测结果可靠性较差，失去了这种检测的权威性，大大影响了这种先进方法的推广应用，如不从各方面加以改进，这项技术的应用在我国可能夭折。

迄今，PCR检测试剂的主要成份为：Taq DNA聚合酶(Taq Polymerase)、引物(Primers)、反应缓冲液(Reaction Buffer)和核苷酸(dNTP)。此外，有的试剂盒中还配有阳性对照。

传统的检测过程包括：1)血样处理；2)标本制备；(3)在PCR仪中按一定的温度——时间程序进行热循环反应；4)取一定量的反应产物用琼脂糖电泳分离，然后用溴乙锭染色；5)在紫外透射仪上观察反应结果。

传统PCR检测试剂的反应结果判定依据是：在紫外光下出现条与阳性对照相同的DNA条带则为阳性，没有出现条带则为阴性。

现有PCR检测试剂的这种检验结果判定依据存在一个漏洞：没有出现条带也可能是PCR不成功，即没有实现正常反应。造成PCR不成功的因素是普遍存在的，诸如：1)试剂质量不佳或因种种原因试剂失灵；2)检测过程每个环节中任一环节操作不当；3)PCR仪工作不正常或循环程序有误。这就是说，没有出现条带可能是真阴性也可能是假阴性。在我国目前的条件下假阴性的比率是很高的，连检验人员和医生都不敢相信阴性检测结果是不是真阴性。

发明的目的：制造一种内含质控的新型PCR检测试剂，这种试剂能自行区分检测结果是真阴性还是假阴性，即能识别假阴性。

本发明是通过以下的途径实现的：

取一段PCR阳性产生的DNA片段，在此片段的中央，用分子生物学方法(基因克隆方法)插入一段外源DNA序列，构造成一种特殊的DNA片段(即特殊结构的分子——嵌合的分子)。用此特殊结构的分子作为内含质控模板，加入聚合酶链反应(PCR)。反应结果，将产生一条比阳性PCR产物的分子量更大的DNA片段。这样，如果PCR是成功的，不论反应是阳性还是阴性，反应产物电泳后，此片段都将出现——在紫外光下现出一条特定的条带。如果PCR不成功，“产物”电泳后，在紫外光下将不出现此条带(无条带)。这样，当用内含质控模板的试剂盒进行PCR检测时，若被测标本为阳性反应，反应产物电泳后在紫外光下就会出现两条DNA条带；当被测标本为阴性反应时，则会有一条DNA条带；当没有条带出现时，则为假阴性，即PCR不成功。

为了实现上述检测方法，将此特殊DNA质控模板加入到由聚合酶引物、反应缓冲体系和核苷酸组成的PCR检测试剂盒的反应缓冲体系中，构成本发明所用的内含质控模板PCR检测试剂盒。

本发明还提供一种获得上述特殊DNA质检模板的具体方法，详细操作如下：

(1)取阳性标本，用PCR的引物进行PCR，得到一份PCR的阳性产物(例如，分子量为250bp的阳性产物)，如图1。

(2)将此产物(分子)两端磷酸化，平头末端连接到载体质粒(例如PBR322)中的限制性内切酶位点上，如图2。

(3)将上述阳性产物DNA段的中央用限制性内切酶切开，然后用平头连接法插入一段外源DNA(例如300bp的酵母蛋白DNA)，如图3A、3B。

(4)把扩增后的含有外源DNA(TBP DNA)的阳性产物的特殊DNA片段切下(如图4A)，将此特殊DNA片段(即特殊结构的分子)加入到PCR过程中(如图4B)，如果PCR是成功的，则该DNA片段便被扩增而电泳后在紫外光下必出现一条特定的识别条带。

本发明与现有技术相比其特点及积极效效果：