[发明专利]分离表型相关基因的方法及其装置

说明书

本发明涉及从有某种确定表型的人或高等动植物的复杂基因组中分离该表型相关基因DNA片段的方法及其装置。特别是涉及一种可直接准确地分离出全基因组DNA链中任何部位、任何类型的表型相关基因DNA片段的方法及其装置。

本发明的现有技术中，从复杂基因组中分离表型相关基因片段则面临两个困难：(1)表型相关基因片段包含多种类型，如遗传系中血亲同一型片段或等基因系(高等生物同一个体的体细胞系，植物的单克隆品系和动植物培养细胞单克隆系)中突变片段；重排型突变(基因的缺失、插入、倒位等)、点突变(碱基置换和小的缺失、插入)或去甲基化突变片段；单基因型突变或多基因型突变片段。然而目前还没有一种可分离出上述所有类型突变片段的方法。(2)人或高等动植物的基因组庞大复杂，如人的基因组包含60亿核苷酸对，它可被限制酶切成10⁷种易于杂交识别的小片段。然而无论是杂交识别还是剂量比较都达不到10^-7的分辨率(即分辨出两个基因组间10⁷分之一的差异)。任何分离基因方法首先必须把基因组的复杂度降至10²以下，才能进行分辨和分离。现有技术或者以降低灵敏度(减少被检基因组范围)为代价降低复杂度，或者不能把复杂度降低到可分辨的程度，因而缺乏较高的灵敏度和分辨率。在现有技术中，依据分离的突变类型不同，分离基因方法可分为三类：(1)功能克隆法：提纯某种已知功能蛋白质，测其氨基酸顺序，进而推断出其相关基因结构。由于细胞中往往含有上万种蛋白质，大多数种含量极微，难以提纯和分析，这类方法仅适用于极少数蛋白质表达量高的基因的分离。(2)定位克隆法：通过某种表型在遗传家系中与一些位点标记间连锁分析把表型相关基因定位在染色体某区域中。这类方法仅适用于容易找到遗传家系的植物基因或者人类单基因遗传病相关基因的分离。(3)表型克隆法：通过有相同表型的遗传家系中不同个体基因组间杂交分离遗传性血亲同一片段(IBDF，idendical-by-desend-fragment)，或者通过有不同表型的同一个体细胞基因组间杂交或带型比较分离重排型突变。近年来，大量的研究表明，人类大多数致命性疾病，例如恶性肿瘤、脑血管病、心脏病、II型糖尿病、骨质疏松症、老年痴呆症等，甚至人类的衰老都是由多位点、体细胞性点突变所引起的。而现有技术均不适用分离这一类突变片段。本发明所确立的基本方法则可以用于分离这些人类致命基因(R.Nowak，Science，270(1995)，P368-371；P.Aldhous，Science，265(1994)，P2008-2010；J.J.Jonsson et al.，Proc. Natl. Acad.Sci.USA，92(1995)，P83-85)。在现有技术中依据减少基因组的复杂度方式不同，分离基因方法可分为二类：(1)通过特异探针标记(杂交)或特异引物PCR扩增选择性分离基因组中部分区域中基因。这类方法以减少被筛查基因组区域为代价来减少基因组复杂度，因而势必降低其灵敏度(N.Lisitsyn，et al.，Science，259(1993)，P946-951；P.Liang，et al.，Nucl.Acid.Res.21(1993)，P3269-3275)。(2)在杂交前把基因组DNA片段单向电泳或带型比较前把基因组双向电泳，使DNA片段分散到10³～10⁴位点上，从而把每个位点上片段种类减少到10⁴以下。这类方法虽然没有减少其灵敏度，但也没有将基因组复杂度减少至10²以下可分辨的程度(L.C.Au，et al.，86(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，P5507-5511；H.Yokota，et al.，219(1994)，Analy.Biochem.，P131-138；H.Nakashime.227(1995)，Analy.Biochem.，P319-327)。故而针对现有技术中所存在的问题，研制一种可对全基因组中任何部位任何类型突变片段进行直接分离的新型的分离表型相关基因的方法及其相关装置。