[发明专利]设计具有预定特性的α－淀粉酶突变体的方法

权利要求书

1.一种构建一种亲代类Termamylα-淀粉酶的变体的方法，该变体具有α-淀粉酶活性，而且，与所述亲代α-淀粉酶相比具有至少一种改变了的特性，所述方法包括：

i)分析亲代类Termamylα-淀粉酶的结构，以确定该类Termamylα-淀粉酶结构的至少一个氨基酸残基或至少一个结构部分，据信该氨基酸残基或结构部分与改变所述亲代类Termamylα-淀粉酶的所述特性相关(根据结构或功能因素进行评价)，

ii)构建一种类Termamylα-淀粉酶变体，与亲代类Termamylα-淀粉酶相比，该变体上在i)中所确定的氨基酸残基或结构部分已被修饰过，以改变所述特性，和

iii)检验所得到的类Termamylα-淀粉酶变体的所述特性。

2.如权利要求1的方法，其中，所述待改变的特性选自底物特异性、底物结合力、底物裂解方式、温度稳定性、依赖于pH的活性、依赖于pH的稳定性(特别是在低(例如pH＜6)或高(例如pH＞9)pH值下的较高的稳定性)、对氧化作用的稳定性、Ca²⁺依赖性和比活性。

3.如权利要求1或2的方法，其中，所述待改变的特性为钙离子依赖性，而待修饰的结构部分选自C结构域、A结构域和B结构域之间的界面、A结构域和C结构域之间的界面、或与所述类Termamylα-淀粉酶的钙结合位点之间的相互作用。

4.如权利要求1或2的方法，其中，所述待改变的特性为底物裂解方式，而待修饰的结构部分位于距离底物结合位点的一个氨基酸残基10_以内处。

5.一种构建一种亲代类Termamylα-淀粉酶的变体的方法，该变体具有α-淀粉酶活性，而且，与所述亲代α-淀粉酶相比具有一种或几种改变了的特性，所述方法包括：

i)比较所述类Termamylα-淀粉酶与一种非类Termamylα-淀粉酶的三维结构，

ii)确定所述类Termamylα-淀粉酶结构上的一个不同于所述非类Termamylα-淀粉酶结构的部分，而且，从结构或功能角度考虑，该部分被认为能决定所述类Termamylα-淀粉酶与非类Termamylα-淀粉酶之间一种或几种特性的差异，和

iii)修饰在ii)中确定的所述类Termamylα-淀粉酶的部分，以得到一种类Termamylα-淀粉酶变体，该变体的一种或几种特性与其亲代类Termamylα-淀粉酶的不同。

6.如权利要求6的方法，其中，在步骤iii)中对所述类Termamylα-淀粉酶的部分进行修饰，以使其类似所述非类Termamylα-淀粉酶的相应部分。

7.如权利要求5或6的方法，其中，在步骤iii)中的修饰是这样实现的：使所述待修饰的类Termamylα-淀粉酶的部分缺失一个或几个氨基酸残基；用占据所述非类Termamylα-淀粉酶的相应位置的氨基酸残基取代所述待修饰的类Termamylα-淀粉酶的部分的一个或几个氨基酸残基；或将存在于所述非类Termamylα-淀粉酶上的一个或几个氨基酸残基插入所述类Termamylα-淀粉酶上的相应位置。

8.如权利要求5-7中任一项的方法，其中，所述非类Termamylα-淀粉酶结构是一种真菌α-淀粉酶或哺乳动物α-淀粉酶的结构。

9.如权利要求8的方法，其中，所述非类Termamylα-淀粉酶是米曲霉TAKAα-淀粉酶，黑曲霉酸性α-淀粉酶、枯草杆菌α-淀粉酶或猪胰α-淀粉酶。

10.如权利要求1-9中任一项的方法，其中，所述亲代类Termamylα-淀粉酶源于一种芽胞杆菌属菌株。

11.如权利要求10的方法，其中，所述亲代α-淀粉酶源于一种地衣型芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌菌株，或源于一种嗜碱性芽胞杆菌菌株，如NCIB 12289、NCIB 12512或NCIB 12513。

12.如权利要求1-11中任一项的方法，其中，所述亲代α-淀粉酶是一种杂合的α-淀粉酶，其包括源于至少两种α-淀粉酶的部分氨基酸序列的一种组合，其中，有一种为类Termamylα-淀粉酶，另外的为源于诸如微生物和/或哺乳动物的α-淀粉酶。