[发明专利]分支杆菌蛋白质、其产生菌和作为疫苗和检测结核病的用途

说明书

本发明的目的是分支杆菌蛋白质和产生它们的微生物。

本发明还涉及这些蛋白质在疫苗或用于检测结核病中的用途。

结核病一直是世界范围内的公共健康问题。每年因结核病导致的死亡量为约3百万，而结核病的新发病人数为约1千5百万。因结核病导致的死亡数甚至在发达国家中也很高；例如在法国，每年为1500，如果考虑在官方数字和全身尸检结果之间Roujeau估计的差异，这个数字肯定被低估了2或3倍。最近，结核病的增加或至少这种病的发病率没有降低可能是与HIV/AIDS的传播有关。总之，在法国和发达国家，就发病率而言，结核病仍是主要的感染性疾病，而在发展中国家，结核病仍是与单种疾病有关的人口损失的主要原因。

目前，通过从患者取样，培养其中的细菌而进行的明确诊断不到结核病的一半。甚至占结核病80-90％的、通过检测细菌最容易诊断的肺结核病，咳出物检测阳性不到病例的一半。

更敏感技术，如PCR(聚合酶链反应)的发展总是要遇到如何得到样品的问题。妇女和儿童不能正常刺穿，而婴幼儿的样品经常需要相对特殊的医学介入(例如神经节活检或通过头脊柱液的腰穿刺取样)。

在其它方面，PCR反应本身存在抑制，使得该技术对于一些样品是不可行的，因为不能控制其来源。

最后，由于其敏感性的限制(在样品中的量在10⁴-10⁵个细菌范围内)，经典细菌学诊断，显微镜检查和培养要求已经有相当量的细菌，并因而病情有相当发展。

因此，检测抗结核分支杆菌的特异性抗体有助于诊断检测细菌本身很困难或不可能的常见的疾病形式。

几代研究人员的不断努力已经发展了一种完善的结核病血清学诊断技术。

综合该领域中所完成的研究，需要提及PCT申请WO-92/21758。

因此，在现有技术中报道的技术大部分是以开始分离蛋白质到检测其生物化学特性为基础的。在所述分离前，作者就已试验了这些蛋白质检测患结核病的个体的能力。

PCT申请WO-92/21758描述了用源自患结核病的患者或活细菌免疫的豚鼠的血清，清楚筛选结核感染代表性抗原的方法。与现有技术描述的大部分试验不同，用该方法分离了分子量在44.5-47.5KD之间的牛分支杆菌蛋白质。

确定这些蛋白质之一的N-末端的17个氨基酸，而且所述氨基酸如下：ALA-PRO-GLU-PRO-ALA-PRO-PRO-VAL-PRO-PRO-ALA--1   2   3   4   5   6   7    8   9   10  11ALA-ALA-ALA-PRO-PRO-ALA 12 13  14   15  16  17

ROMAIN等人的文章(1993，感染和免疫，61，742-750)基本上说明了在该国际申请中所述的结果。它更具体地描述了使用通过免疫兔得到的抗上述45-47KD蛋白质复合物的兔多克隆免疫血清的竞争性ELISA试验。

同时，JACOBS等人(1991，酶学方法，204，537-557)构建了结核分支杆菌的基因文库。

该文库含大量不同的克隆。

WIELES等人(1994，感染和免疫，62，252-258)鉴定并测序了来自另一分支杆菌种，麻风分支杆菌的蛋白质。称为43L的该蛋白质，从核苷酸序列推导的分子量为约25.5kDa。其N末端与在牛分支杆菌BCG中鉴定的45-47KDa复合物(上文给出了其N末端的17个氨基酸序列)有47％的同源性。

如上所述，在人类医学中从治疗和诊断方面看，精确鉴定由分支杆菌，特别是由结核分支杆菌生产的蛋白质是非常有意义的。

实际上存在并尚未解决的问题是如何得到对抗大量疾病的疫苗。

另一问题是如何检测由分支杆菌引发的疾病，如结核病。

因此，本申请人努力确定一种结核分支杆菌蛋白质的序列，该蛋白质可能在免疫应答中起重要作用。

本申请人证明相当于上述45-47KD复合物的蛋白质组由一种相同的基因编码，因为其Pro丰富，所以计算的分子量不同于在聚丙烯酰胺凝胶上估计的分子量。

因此，本发明的目的是提供至少有下列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3之一部分的蛋白质：