[发明专利]DNA序列

说明书

本发明涉及修饰的植物。更具体地说，本发明涉及以使得植物至少一部分(例如该植物的种子)能够产生商业上有用的油脂(oil)的方式修饰的植物。

长期以来，植物一直是商业上有价值的油脂源。植物来源的油脂之营养用途迄今为止一直占统治地位，但是目前注意力又转移到工业用油脂源的植物上，如代替或改进矿物油脂。油料种子(如芸苔)中含有各种脂类(Hildish和Williams，“天然脂类的化学组成”，Chapman Hall，伦敦，1964)。对通过利用重组DNA技术改变脂类组分存在大量兴趣(如Knauf，TIB tech，1987年2月，40-47)，但到目前为止，尽管这种技术的复杂性一直在增加，但由于各种原因，这种技术绝不可能实现所有的目标。

制作植物来源之油脂的脂类成分的成功要求扎实地理解相关的生物化学和基因的知识。广义来讲，这两个方面是可以达到的。首先，可以修饰植物以便使对这种植物来说是新的的脂肪酸合成，这样，例如，可以在芸苔中合成月桂酸和/或硬脂酸。此外，可以改变脂肪酸在脂类的甘油骨架上的掺入模式和/或者程度。本发明涉及的是后一方面。

通过一序列酰基转移酶将脂肪酸部分加入到甘油骨架上而在植物中形成脂类。在甘油分子上存在可以取代脂肪酸(酰基)部分的三个位置，每个位置的取代通过位置特异性酶催化完成。这些酶是甘油-sn-3-磷酸盐酰基转移酶(1-酰基转移酶)、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸盐酰基转移酶(2-酰基转移酶)和sn-1，2-二酰甘油酰基转移酶(3-酰基转移酶)。

当前，植物中“脂类工程”的一个(但不是唯一的)目标是提供包括具有高含量顺芥子酸脂类的油和/或包含三芥酸精(trierucin)油脂。包含顺芥子酸脂类由于各种目的商业上希望得到，特别是在一定的情况下作为矿物油的代替品或补充，这一点上文已提及。就油料种子芸苔(Brassica napus)来说(当今栽培中产生油脂最重要的作物之一)，2-酰基转移酶的特异性能绝对区分2位上掺入的顺芥子酸。这样，既使是这些芸苔的栽培品种能够在1位和3位上掺入顺芥子酸，对顺芥子酸也没区别(至少是减少)，只有最多66％掺入到三酰基甘油中的脂肪酸可以是顺芥子酸。已知这种品种是HEAR(高顺芥子酸芸苔)变种。

因此希望产生这样的植物，即常规的油料种子芸苔以及HEAR品种，这种植物含有有用水平的三芥酸精和/或含有高水平的顺芥子酸和/或含有在2位掺入的顺芥子酸的油脂；同样的油脂是其它植物油料(oil)作物的油脂，如玉米、向日葵和大豆等等，仅列出几例。而原则上认为将编码不同脂肪酸特异性的2-酰基转移酶的DNA引入(例如，从一种不同的植物中)到需要的植物中是可能的，但在实施上存在很多问题。

形成三酰甘油的酰化作用途径所有相关的酶都是膜结合的。有1-酰基转移酶、2-酰基转移酶、3-酰基转移酶，它们存在于细胞质的内质网中。还没有纯化它们。这使得对它们的操作很困难，并不能使用很多常规的DNA克隆方法。奇怪的是，在克隆编码可溶性的Choroplasticl-酰基转移酶的基因(或至少是cDNA)时不存在这种困难。事实上，为一个完全不同的目的，一直在进行有关这个酶的重组DNA工作，即Murata等(自然356710-713(1992))进行的提高烟草植物叶片抗寒性的工作。

Welter等在脂肪科学技术，93，No 8：288-89(1991)中提出克隆膜结合酶(如2-酰基转移酶)的策略，尽管没有给出范例。

WO-9413814公开了一种2-酰基转移酶的DNA序列(和相应的蛋白质序列)。这种来自玉米的序列用于转化植物，改变了该植物2-酰基转移酶正常的底物特异性。该公开内容也包括来源于玉米2-AT的cDNA序列用于定位来源于芸苔属和菜属(Limnanthes)物种的高度同源性的2-ATs。

目前已经惊奇地发现，事实上在菜属中存在另一种在芸苔中没有同系物且是种子特异性的2-AT。这种2-AT能够在2-位上掺入顺芥子酸，这种情况，例如在芸苔天然的2-AT中是不存在的。

因此，本发明的第一个方面提供了重组的或分离的DNA序列，这种序列编码一种具有膜结合的(membrane-bound)2-酰基转移酶活性的酶，这些序列选自：

(i)DNA序列，这种序列包含图3的DNA序列或其互补链；

(ii)核酸序列，这种核酸序列在严格条件下能和图3的DNA序列或其互补链杂交；

(iii)核酸序列，这种核酸序列在没有遗传密码的简并性时能和图3的DNA序列或其互补链杂交。