[发明专利]获得细胞和创伤处理用的新型的、确定的酶混合物

说明书

本发明涉及从溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)中提纯的酶的具有确定组成的混合物以一种可重复的、标准化的方式从人或动物组织中获得细胞或组织碎片的用途，以及这些提纯的酶用于创伤处理的应用。

从组织中分离细胞的方法应当是可重复的，而且应该保证对所获得的细胞造成的伤害最小。通常，来自溶组织梭状芽孢杆菌的具有不确定组成的含胶原酶的制剂被用于这一目的，但上述目标不能以此可靠地完成。而使用其它的酶制剂或非酶方法则是少见的或只能提供较差的分离结果(1)、(9)。

通常使用的或被推荐使用的含有胶原酶的制剂(2)是从溶组织梭状芽孢杆菌的培养液的滤液中获得的，除了含有多种胶原酶和蛋白酶(3a)、(3b)外，它还含有由于蛋白水解作用而形成的这些酶的裂解产物以及其它的成分，其中一些成分是有害的而且不知其为何物。

根据现阶段的知识，以一种来自溶组织梭状芽孢杆菌的单一的酶获得较高产量的活细胞是不可能的。相反，为了使组织有效地分解，需要来自这种细菌的各种酶的共同作用。然而，为达到这一目的所需的酶量的比率迄今为止还没有被公开，使用者也得不到来自溶组织梭状芽孢杆菌的酶的确定混合物。

基于上述问题，许多研究组织致力于使用提纯的酶从组织中分离细胞。然而，这些研究都没能导致使用纯酶或任何完全确定的混合物。

Suggs等人(4)使用一种混合物分离了人的静脉内皮细胞，该混合物由提纯了的胶原酶级分以及提纯了的来自牛胰脏的胰蛋白酶组成。然而，所使用的富集了的胶原酶级分没有各种酶的确定的组成，它还含有少量的诸如梭菌蛋白酶的物质，这个分离结果与使用具有不确定组成的含有胶原酶的制剂所得到的结果没有明显的差别。使用上述混合物的单一组分是不可能获得令人满意的组织解离的。然而，使用胰蛋白酶用于细胞分离也不是没有问题，因为这种蛋白水解酶破坏细胞膜的蛋白质。因而，举例来说，它对连接在肝膜和脂肪细胞上的胰岛素有损害作用。

Hefley(6)、(7)应用提纯的胶原酶级分的混合物从小鼠的颅骨中分离骨细胞。在这之前(7)，该作者报道了使用纯提的胶原酶级分与中性蛋白酶的混合物成功地分离这些细胞的可能性。然而，在上述两个研究中都使用了来自分离柱的洗脱液，其中底物专一性不同的各种胶原酶的含量和其它成分的含量都是未知的。

Wolters等人(8)使用中性蛋白酶和由Sigma提供的“VII型胶原酶”的混合物来从大鼠的胰脏内分离岛细胞，尽管并不知道这种混合物中所含有的各种胶原酶的种类和数量。另外，它还含有少量的梭菌蛋白酶和“非特异性蛋白酶”。中性蛋白酶被以一种高度纯化的形式使用。上述两种组分的混合物产生了较多数量的活体岛细胞。

本发明涉及高纯度的HP胶原酶、AZ胶原酶以及弹性蛋白酶这些单独的酶，也涉及它们的混合物。

在以合成的六肽Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala作为底物的Graβmann和Nordwig(11)的分析中，HP胶原酶的比活至少是20U/mg，优选为至少50U/mg。如果用于医药目的，其优选的比活是100U/mg或更高。

在使用阿佐考(Azokoll)作为底物的Mandl等人(12)的分析中，AZ胶原酶的比活至少是10U/mg，优选为至少30U/mg。如果用于医药目的，其优选的比活是50U/mg或更高。

在以来自牛颈部韧带的弹性蛋白为底物所进行的分析中，弹性蛋白酶的比活至少是2U/mg，优选为至少5U/mg。如果用于医药目的，其优选的比活是12U/mg或更高。

本发明还涉及使用一种HP胶原酶和弹性蛋白酶的混合物，加入或不加入AZ胶原酶和/或梭菌蛋白酶，用以从人或动物组织中分离细胞或组织碎片。

本发明还涉及这些酶单独或作为混合物的组分的直接或间接的应用，用于医疗用途，例如用于创伤处理。

为了用于组织解离，举例来说，可将混合物以冷冻干燥形式装入小瓶中，其中的量足以使一只大鼠的肝脏(该器官的湿重大约为9-11g)解离。

合适的混合物至少含有下列提纯的酶中的两种：HP胶原酶(50-300U；优选为70-170U)和弹性蛋白酶(5-70U；优选为10-25U)，加入或不加入AZ胶原酶(1-20U，优选是2-8U)和/或梭菌蛋白酶(10-280U，优选是20-50U)。上述数字显示的是一个单元-例如一支小瓶中-的混合物所具有的量。