[发明专利]生物分子的检测方法

说明书

发明所属技术领域

本发明涉及用于检测介质中催化活性的核酶存在的方法和试剂盒。本发明的方法和试剂盒在方法和试剂盒用于检测在试验样品中特异性生物分子的存在的范围之内是有用的。

发明背景

检测特异性生物分子(如DNA或RNA序列、蛋白质、抗原、抗体等)在样品中存在是各种实验、诊断的和治疗用途的需要。许多测定可用于检测蛋白质生物分子，如凝胶电泳图、HPLC、亲和色谱法以及其它基于使用适当的标记探针进行的测定。在这样的测定在其中要检测的蛋白质生物分子存在足够大的数量时是令人满意的同时，它们也时常不够灵敏到足以使得可以进行少量生物分子的检测。

DNA或RNA序列可通过使用标记的探针检测。在检测的DNA或RNA序列仅以十分小的量存在时，它们必须通过一些方法如LCR(连接酶链反应)，SSR(自动维持序列扩增)或PCR(聚合酶链反应)扩增。

虽然扩增方法如PCR对基础研究具有极大的影响，它们在过渡到临床设备却是缓慢的。这一点的首要原因是与样品的临床环境结合的自动化的需要产生了复杂、缓慢而昂贵的处理。对环境因素高度敏感性的蛋白质酶的需要使精确控制的环境成为必要(在其中操作这些酶)。典型地，临床样品包含许多组分，它们可干扰酶进行其催化活性的能力。此外，用于样品制备以释放核酸的标准方法(如胍硫氰酸或酚抽取)不适用于以蛋白质为基础的酶促活性，因而必须从样品制剂中除去靶核酸。

核酶典型地是具有类酶促催化活性的RNA分子，这种活性通常是核酸序列的裂接、剪接和连接。尽管曾有证明核酶可作用于DNA分子和蛋白质，核酶的已知底物是RNA分子。

参与胞内反应的天然核酶以顺式起作用，仅催化单一的转换，在反应期间通常进行自身修饰。然而，可以对核酶工程操作以使其按真正的催化方式以反式作用，转换大于一而不进行自身修饰。在核酶中可鉴别出两个明显的区：结合区(使核酶具有和特异性核酸序列(也可能是特异性蛋白质)杂交的特异性)和催化区(使核酶具有裂解、连接或剪接活性)。每组核酶使用不同的作用机制裂解不同的核苷酸序列。每组可按对其催化活性是必须的核苷酸碱基的数目以及核酶和靶序列的特异性程度进一步区分(Robert H.Simons，生物化学年评，61，641-671，(1992))。

为了治疗疾病或遗传失常，最近提出了使用核酶裂解靶RNA，如病毒RNA或从从应关闭的基因转录的信使RNA。这种方法作为通过使用反义序列以封闭RNA转录的替代方法提出。由于核酶的催化性质，单一的核酶分子可裂解许多靶RNA分子，因此可以以比反义治疗所需的浓度相对更低的浓度达到治疗活性(WO 96/23569)。

很少有提及核酶用于诊断目的的用途。WO94/13833描述了一种检测溶液中核酸分子的方法，这种方法通过制作(tailoring)具有两个区的特异性核酶分子，其中一个和待检测的核酸序列互补，另一个和带有可检测的标记的共靶分子互补。核酶可特异性地并反向结合选择的靶核酸序列和和标记的共靶。靶和共靶均结合时，核酶进行构型改变，这使其具有活性并可把标记从共靶裂解掉，然后检测游离的标记。通过共靶的裂解，核酶可与另外的共靶再结合，裂解更多的标记并产生更多的可检测信号。

尽管WO94/13833的发明人称它们的发明“信号的扩增”，实际上产生的核酶数目无扩增，而反应是纯粹的酶促反应，其中催化物质(在核酶的情况下)裂解底物(在共靶的情况下)，然后解离并裂解另一种底物。没有发生参与反应的活性核酶的数量的真正扩增。

术语表

下面是用于下列说明书和权利要求书的术语表。然而，这个术语表不应分离地考虑，要完全理解各种术语和这些术语在本发明上下文中的意义，术语表应结合本说明书的其余部分阅读。

核酶-具有类酶促催化活性的核酸分子。尽管通常在本发明的上下文中该术语用于指催化活性的(类酶的)寡核苷酸，在本领域中所使用的术语“核酶”指具有作为催化活性的RNA分子。这样，本发明的核酶可以是RNA分子，可以是包含dNTPs或完全由dNTPs组成的寡核苷酸，也可以包括各种非天然产生的核苷酸，如IsoG或IsoC 5′-O-(1-硫代-鸟苷三磷酸)核苷酸和5-O-甲基核苷酸。可按照本发明使用的核酶可如上所述专一由核酸组成，或其催化活性需要辅因子。核酶可以具有寡核苷酸序列的裂解、连接、剪接或剪除(splicing out)(除去)、向寡核苷酸序列添加基团、核酸序列的重排等催化活性。

测定的生物分子-在待检测的试验样品中存在的分子。它可以是寡核苷酸或识别对的成员，如受体/配体、抗体/抗原、外源凝集素/糖蛋白等。